移植腎急性排斥相關(guān)免疫基因芯片的構(gòu)建及臨床應(yīng)用的初步探討.pdf

1、目的：構(gòu)建與免疫基因相關(guān)的基因芯片，并利用其篩選出與急性排異反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因。對篩選出表達(dá)量增高的基因，通過聚類分析，確定高表達(dá)基因，并用定量PCR對該高表達(dá)基因進(jìn)行定量分析，從而驗(yàn)證構(gòu)建基因芯片的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。對具有代表性的基因進(jìn)行臨床應(yīng)用的初步研究。 方法：通過自行設(shè)計(jì)的包含有CD分子、細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子、FasL、穿孔素、顆粒酶B等共475個(gè)免疫相關(guān)基因的基因芯片，對臨床上腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)和非急

2、性排異反應(yīng)患者進(jìn)行了研究。以手術(shù)后第四天和移植腎腎穿刺活檢當(dāng)日/隨訪日收集外周血作為對照血樣和實(shí)驗(yàn)血樣，用Ficoll技術(shù)提取外周血淋巴細(xì)胞，并采用一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA探針，熒光染料標(biāo)記后，與芯片進(jìn)行雜交，掃描后篩選出差異表達(dá)基因。對篩選出表達(dá)量增高的基因，通過聚類分析，確定高表達(dá)基因，并用定量PCR對該高表達(dá)基因進(jìn)行定量分析。根據(jù)發(fā)現(xiàn)與急性排斥反應(yīng)相關(guān)的基因，初步探討其在移植腎急性排斥反應(yīng)發(fā)生中的機(jī)理；對具有代表性的

3、穿孔素、顆粒酶B、IL-4進(jìn)行PCR定量，并對穿孔素、顆粒酶B進(jìn)行臨床應(yīng)用研究。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞中與急性排斥反應(yīng)可能相關(guān)的免疫基因，篩選出急性排斥反應(yīng)時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)差異的基因，其中急性排斥發(fā)生時(shí)外周血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因差異表達(dá)上調(diào)20條，包括：IL-4、IL-6、IL-10、IL-2、IL-15、INF-γ、TNF-α、CD126、CTLA-4、IL-5、IL-13、IL-18、CD40L、Perforin、Gra

4、nzymeB、FasL、MCP1、CD30、HLA-DR、MIP-1。下調(diào)11個(gè)基因，包括：TGFB1、RAB5C、RAB6C、RAB10、IL-17、IL-12、CD4、CD47、CD24、CD79B、CD81。而在非急性排異組患者中并沒有發(fā)現(xiàn)上述基因的顯著改變。對其中的穿孔素、顆粒酶B、IL-4進(jìn)行實(shí)時(shí)免疫熒光PCR定量驗(yàn)證，證實(shí)他們在急性排異反應(yīng)時(shí)較腎功能穩(wěn)定時(shí)出現(xiàn)量上出現(xiàn)顯著性升高(P<0.05)，治療后顯著下降(P<0.05)

5、。 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對臨床上38例移植腎急性排異反應(yīng)和20例移植腎功能穩(wěn)定患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞的穿孔素mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應(yīng)的敏感度為86.8％，特異度為80％。臨床應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞的顆粒酶mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應(yīng)的敏感度為86.8％，特異度為90％。臨床應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞的IL-4的mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應(yīng)的敏感度為86.8％，特異度為75％。 結(jié)論：本課題

6、通過自行設(shè)計(jì)的具有475個(gè)免疫相關(guān)基因的基因芯片，對臨床上腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者進(jìn)行了研究。并應(yīng)用PCR定量驗(yàn)證，結(jié)果顯示此基因芯片具有良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。發(fā)現(xiàn)了外周血淋巴細(xì)胞中與急性排斥反應(yīng)可能相關(guān)的免疫基因，篩選出急性排斥反應(yīng)時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)差異的基因，其中急性排斥發(fā)生時(shí)外周血淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因差異表達(dá)上調(diào)20個(gè)、下調(diào)11個(gè)。對具有代表性的穿孔素、顆粒酶B、IL-4進(jìn)行PCR定量，發(fā)現(xiàn)三者在移植腎急性排異反應(yīng)時(shí)明顯升高。臨床