CHIKV、SINV和JEV可視化基因芯片的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、基孔肯雅病毒(Chikungunya Vrus，CHIKV)和辛德畢斯病毒(Sindbis Virus，SINV)是甲病毒屬單鏈RNA病毒，經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，有致病快，傳播迅速等特點(diǎn)，其流行對(duì)世界公共安全造成威脅。目前缺乏對(duì)兩種病毒引起疾病的有效治療藥物，因此，對(duì)兩種病毒快速有效地進(jìn)行診斷是預(yù)防控制和減緩病毒傳播的重要措施。
　　乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是RNA

2、病毒，能引發(fā)病毒性的腦炎，經(jīng)庫(kù)蚊等在動(dòng)物與人之間傳播。在亞洲的東部和南部及太平洋等地區(qū)廣泛流行。目前已應(yīng)用乙型腦炎疫苗防治，但尚缺乏特異性抗病毒藥物，因此，對(duì)乙型腦炎的早期診斷顯得極為重要。
　　基因芯片技術(shù)(Gene Chip Technology)有較高的特異性和靈敏度及高通量等特點(diǎn)，在對(duì)環(huán)境和臨床檢測(cè)上有良好的應(yīng)用。目前有多種基因芯片技術(shù)，以熒光、同位素、酶標(biāo)標(biāo)記在核酸檢測(cè)中比較普遍。但有靈敏度較低，操作復(fù)雜，對(duì)條件和設(shè)備有

3、著較高的要求等問(wèn)題，限制了這類(lèi)技術(shù)在檢測(cè)病例中的應(yīng)用。納米金標(biāo)記比熒光標(biāo)記檢測(cè)在敏感性上高100倍，簡(jiǎn)便快速，不需特殊的儀器，結(jié)果肉眼可看見(jiàn)。本文將納米金標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在可視化基因芯片制備中，旨在建立對(duì)CHIKV、SINV和JEV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉、操作簡(jiǎn)單的診斷研究的可視化基因芯片方法，分別探討了CHIKV和SINV熒光檢測(cè)基因芯片和可視化檢測(cè)基因芯片的制備及兩者的比較與JEV可視化分型基因芯片的制備。主要內(nèi)容包括:
　　一、C

4、HIKV和SINV可視化檢測(cè)基因芯片和熒光檢測(cè)基因芯片的研制及兩者之間的比較
　　本實(shí)驗(yàn)室已初步建立了CHIKV和SINV熒光檢測(cè)基因芯片，在此基礎(chǔ)上，建立了兩種病毒可視化檢測(cè)基因芯片和熒光檢測(cè)基因芯片。我們以已有CHIKV和SINV E基因序列為模板，重新設(shè)計(jì)檢測(cè)探針和引物并對(duì)探針進(jìn)行氨基修飾，對(duì)引物進(jìn)行熒光素/生物素修飾。使用芯片點(diǎn)樣儀對(duì)探針進(jìn)行點(diǎn)樣，在37℃的濕潤(rùn)環(huán)境下將檢測(cè)探針固定到醛基玻片上，同時(shí)，以分別含CHIKV和S

5、INV E基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增待檢測(cè)片段，變性后雜交到探針芯片，洗脫后熒光標(biāo)記基因芯片通過(guò)特殊掃描儀掃描分析結(jié)果，而可視化基因芯片利用生物素與鏈霉親和素高度親和的特性在檢測(cè)芯片上標(biāo)記納米金，銀增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)可視化。以酶切鑒定正確的CHIKV和SINV E基因序列為模板反向轉(zhuǎn)錄為RNA模擬真實(shí)的CHIKV和SINV RNA，將CHIKV和SINV RNA分別與提取的PRRSV，JEV-Ⅲ，AIV RNA混合逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR電泳鑒定各病

6、毒cDNA的存在，使用CHIKV和SINV特異引物對(duì)各種病毒PCR擴(kuò)增靶序列并與探針芯片雜交進(jìn)行可視化基因芯片特異性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也進(jìn)行靈敏度、重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，可視化基因芯片比熒光檢測(cè)芯片方法對(duì)CHIKV和SINV的靈敏度檢測(cè)結(jié)果分別為2.4×10-6 ng/mL，2.0×10-8 ng/mL和2.4×10-4 ng/mL，2.0×10-5 ng/mL，兩者與PCR方法比較差異顯著，可視化基因芯片比熒光檢測(cè)芯片靈敏度可高出100倍，并

7、且可視化基因芯片檢測(cè)方法對(duì)兩種病毒都具有良好的特異性和重復(fù)性。
　　二、JEV可視化分型基因芯片的研制
　　本實(shí)驗(yàn)室已初步建立了JEV熒光分型基因芯片，以此為基礎(chǔ)建立了JEV可視化分型基因芯片。將已設(shè)計(jì)的氨基修飾檢測(cè)探針點(diǎn)樣并固定到醛基玻片上，同時(shí)，對(duì)已有引物序列5'末端進(jìn)行生物素修飾，以已有的分別含乙型腦炎病毒Ⅰ型(JEV-Ⅰ)和乙型腦炎病毒Ⅲ型(JEV-Ⅲ)的PrM和E基因序列的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增待檢測(cè)目的片段，變性后雜交到