馬立克氏病病毒CVI988通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及表達(dá)IBDV VP2基因重組病毒的研制.pdf

1、以MDV疫苗作載體構(gòu)建活病毒載體疫苗是近年來禽病毒基因工程研究中比較活躍的領(lǐng)域。多年的生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)了MDV疫苗作為活病毒載體的安全性、有效性。 傳染性法氏囊病IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病。常規(guī)疫苗特別是中等毒力活疫苗免疫雞群是控制IBD的主要方法。然而疫苗造成的免疫抑制，使得雞群易發(fā)其他疫病以及雞群對其他疫苗的效果降低。為此，本研究選用CVI988疫苗作載體，插入IBDVVP2保

2、護(hù)性抗原基因，構(gòu)建重組病毒，為重組馬立克氏病毒基因工程疫苗的深入研究奠定基礎(chǔ)。 1.MDVCVI988通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 根據(jù)Ⅰ型MDV強(qiáng)毒GA株基因序列，設(shè)計(jì)兩對引物，以病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞中提取的病毒基因組總DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出CVI988/Rispens株的US10區(qū)及其側(cè)翼US1和sorf3序列，分別克隆入pGEM-Teasy載體中，陽性質(zhì)粒分別命名為T-US10L，T-US10R，經(jīng)測序表明，克隆

3、的基因片段與Ⅰ型MDV強(qiáng)毒GA株基因序列完全一致。然后將US10R片段插入pUC18載體中，構(gòu)建成功pUC18-US10R質(zhì)粒，再將US10L片段插入pUC18-US10R質(zhì)粒中，構(gòu)建成功pUC18-US10質(zhì)粒。根據(jù)pcDNA3.1載體序列，設(shè)計(jì)1對引物，擴(kuò)增跨幅為1.0kb，包含CMV啟動子和polyA的多克隆位點(diǎn)基因表達(dá)盒，克隆入pGEM-Teasy載體中，陽性質(zhì)粒命名為T-MCS，進(jìn)一步將此多克隆位點(diǎn)基因表達(dá)盒插入上述pUC18

4、-US10質(zhì)粒，構(gòu)建成功馬立克氏病病毒CVI988通用轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC18-US10-MCS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究構(gòu)建的pUC18-US10-MCS通用轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒正確，擁有多個(gè)可利用的單一常用酶切位點(diǎn)，為構(gòu)建馬立克氏病毒重組基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。 2.表達(dá)IBDV-VP2基因的重組MDV的研制 利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pGEM-T-VP2質(zhì)粒，酶切獲得VP2基因片段，克隆入馬立克氏病病毒CVI988通用轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC1