幽門螺桿菌及TNF-α對胃癌培養(yǎng)細(xì)胞α4GnT基因表達(dá)的調(diào)控的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種革蘭氏陰性微需氧菌,1983年Marshal和Warren首次從慢性胃炎患者中分離出來,在人群中的感染率約50％以上。幽門螺桿菌與胃炎、胃潰瘍和胃癌的發(fā)生密切相關(guān),通過誘導(dǎo)宿主的炎癥性因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等多種基因的表達(dá)而致病。1994年世界衛(wèi)生組織將其歸為Ⅰ類致癌原。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是

2、體內(nèi)重要的炎癥性細(xì)胞因子之一,其表達(dá)增加與幽門螺桿菌感染存在密切關(guān)系,并且促進(jìn)了胃炎的發(fā)展。
　　 雖然幽門螺桿菌的感染率很高,但多數(shù)感染者并無臨床癥狀,因此推測人體對幽門螺桿菌有自然防御能力。近年來的研究表明,在胃粘膜的賁門腺、幽門腺、頸粘液細(xì)胞等部位存在α-1,4-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(α-1,4-N-acetyglucosaminyltransferase,α4GnT)。它是一種糖基轉(zhuǎn)移酶,轉(zhuǎn)移N-乙酰葡糖胺到具有核2分支

3、O-聚糖的β半乳糖殘基上形成α-1,4-N-乙酰葡糖胺末端。研究發(fā)現(xiàn),胃腺粘液中末端連接有α-1,4-N-乙酰葡糖胺的O-聚糖粘蛋白具有天然抗菌素的功能。它通過影響幽門螺桿菌的細(xì)胞壁成分膽固醇-α-D-吡喃葡糖苷的生物合成來抑制幽門螺桿菌的增殖、游動并使之變形。推測胃腺粘液細(xì)胞中的α4GnT通過在胃腺粘液蛋白的O-聚糖上生成α-1,4-N-乙酰葡糖胺,來阻隔幽門螺桿菌侵入深層胃粘膜,從而對胃粘膜具有自然保護(hù)作用。因此,我們應(yīng)用胃癌培養(yǎng)細(xì)

4、胞從基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平探明幽門螺桿菌及TNF-α對α4GnT基因的調(diào)控作用。
　　 目的:應(yīng)用表達(dá)α4GnT基因的胃癌細(xì)胞,從mRNA水平和蛋白水平探討幽門螺桿菌與細(xì)胞因子TNF-α對α4GnT基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　 方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):胃癌細(xì)胞株MGC803復(fù)蘇后,培養(yǎng)于含10％FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),傳代后以

5、每毫升3×105個細(xì)胞數(shù)接種于新的培養(yǎng)瓶,將接種后48h的細(xì)胞用于實驗。2.細(xì)菌培養(yǎng):幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株J99復(fù)蘇后,接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(含5％羊血、11μg/ml萬古霉素、11μg/ml兩性霉素B、0.47μg/ml多粘菌素B),置于37℃微需氧條件下培養(yǎng)。3.實驗分組:幽門螺桿菌組:將密度1×105-1×106CFU/ml的幽門螺桿菌與MGC803細(xì)胞共培養(yǎng)6h,換液后繼續(xù)培養(yǎng)至48h。TNF-α組:將終濃度10ng/ml的T

6、NF-α加入細(xì)胞作用48h。對照組:細(xì)胞內(nèi)加入等量無幽門螺桿菌和TNF-α的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h。4.應(yīng)用RT-PCR檢測各組α4GnT基因的mRNA表達(dá)水平,擴(kuò)增片段進(jìn)行8％瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果與內(nèi)參照物GAPDH比較判斷。5.Western Blot檢測各組α4GnT蛋白表達(dá)水平,近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描后,與內(nèi)參照物GAPDH進(jìn)行比較、判斷結(jié)果。6.免疫組織化學(xué)染色方法檢測各組α4GnT蛋白表達(dá)水平,DAB顯色后,光鏡下觀察細(xì)

7、胞,每張蓋玻片計數(shù)5000個細(xì)胞,計算陽性率,各處理組與對照組進(jìn)行比較。7.RT-PCR與Western Blot檢測結(jié)果應(yīng)用凝膠-蛋白分析系統(tǒng)進(jìn)行相對定量分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,兩組間比較用t檢驗。免疫組化結(jié)果以各組細(xì)胞陽性率表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,兩組間比較用x2檢驗。顯著性檢驗水準(zhǔn)為p<0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR檢測α4GnTm

8、RNA表達(dá)結(jié)果:幽門螺桿菌作用于人胃癌細(xì)胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表達(dá)量(0.1160±0.011)與對照組(0.1258±0.00531)比較沒有明顯的差別,統(tǒng)計結(jié)果顯示無顯著性差異,p>0.05；TNF-α作用于人胃癌細(xì)胞MGC803后,α4GnT基因mRNA表達(dá)量(0.474±0.072)與對照組(0.1520±0.001)比較明顯增加,p<0.05。
　　 2.Western Blot檢測α4GnT蛋白表達(dá)

9、結(jié)果:幽門螺桿菌組α4GnT蛋白表達(dá)量(0.2200±0.59)與對照組(0.2120±0.3271)比較沒有明顯的差別,也無統(tǒng)計學(xué)意義,p>0.05；TNF-α組α4GnT蛋白表達(dá)量(0.6180±0.0672)與對照組(0.2080±0.0148)比較增加了3倍,統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性,p<0.05。
　　 3.免疫組化檢測α4GnT蛋白表達(dá)結(jié)果:免疫組化染色后,光鏡下觀察,幽門螺桿菌組α4GnT陽性細(xì)胞數(shù)(2.8％)與對照組α

10、4GnT陽性細(xì)胞數(shù)(3.4％)比較,沒有明顯的增多,統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異,p>0.05；TNF-α組陽性細(xì)胞數(shù)(20.9％)與對照組α4GnT陽性細(xì)胞數(shù)(5.4％)比較有明顯的增加,兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p<0.05。
　　 結(jié)論:1.人胃腺癌細(xì)胞MGC803表達(dá)α4GnT基因2.幽門螺桿菌與胃癌細(xì)胞MGC803共培養(yǎng),并未影響α4GnT基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平發(fā)生明顯的變化。3.TNF-α作用于胃癌細(xì)胞MGC803使其α