肝特異性Lass2敲除促進(jìn)DEN誘導(dǎo)小鼠肝腫瘤發(fā)生伴隨TGF-β1-SmaD-4-PAI-1軸上調(diào).pdf

1、目的: Lass2基因是人和小鼠的長(zhǎng)壽保障基因Lass家族成員。近年來的研究提示Lass2基因全身敲除的小鼠可自發(fā)肝細(xì)胞肝癌?；谏虾Ｊ心[瘤研究所前期研究已獲得肝Lass2基因敲除的雜合子小鼠。因此本研究主要目的是通過配種獲得肝Lass2基因敲除純合子小鼠(Lass2knockout，Lass2 KO)，在此基礎(chǔ)上，采用致癌劑二乙基亞硝胺(Diethylnirtosamine，DEN)誘導(dǎo)肝腫瘤的發(fā)生。探討Lass2基因?qū)Ω渭?xì)胞的保護(hù)作

2、用及其可能機(jī)制，為L(zhǎng)ass2基因突變能否作為肝癌風(fēng)險(xiǎn)因素之一提供詳實(shí)的臨床前研究數(shù)據(jù)，有可能對(duì)預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生、肝癌診斷、個(gè)性化治療有重要參考價(jià)值。
　　方法:應(yīng)用PCR的方法和Western blot和間接免疫熒光染色的方法定性檢測(cè)鼠尾和鼠肝、腦、腎組織基因組中LoxP+/LoxP+、Alb-Cre+、Lass2基因和Lass2蛋白的表達(dá)水平。分別給出生后2w的Lass2 KO小鼠與WT小鼠腹腔注射DEN20 mg/kg作為實(shí)驗(yàn)組

3、，同時(shí)空白對(duì)照組Lass2 KO小鼠與WT小鼠腹腔注射等量生理鹽水。在注射后的第23w和40w分別處死四組小鼠，分別觀察并統(tǒng)計(jì)肝臟的大體形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝體重比、腫瘤的發(fā)生率、腫瘤數(shù)目和體積等指標(biāo)。分別取DEN注射23w和40w的兩組雄性小鼠的肝組織做石蠟切片、HE染色觀察DEN作用后的組織學(xué)改變，免疫組化分別采用EdU染色、PCNA染色和TUNEL染色，熒光顯微鏡下觀察肝細(xì)胞增殖和凋亡情況，并同時(shí)計(jì)算增殖率和凋亡率。然后分別提取兩組

4、空白對(duì)照雄性小鼠的肝組織和DEN注射40w后兩組雄性小鼠的瘤組織與瘤旁肝組織總RNA與總蛋白，通過QT-PCR與Western blot分析癌癥相關(guān)通路。
　　結(jié)果:鼠尾PCR檢測(cè)出現(xiàn)LoxP+/LoxP+和Alb-Cre+特征性條帶的視為為L(zhǎng)ass2 KO小鼠。在Lass2 KO小鼠的肝臟組織中出現(xiàn)Lass2敲除的特征性條帶而腎和腦組織中卻未見此種條帶。Western blot和間接免疫熒光染色也顯示相比WT對(duì)照組小鼠，Lass

5、2蛋白在Lass2 KO小鼠的肝臟組織中不表達(dá)，而在腎和腦組織中均有表達(dá)，且與WT對(duì)照組無顯著差異。分別給Lass2 KO小鼠與WT小鼠腹腔注射DEN，23w后，100％的Lass2 KO小鼠和21.4％的WT小鼠發(fā)生了肝腫瘤。注射40w后，100％的Lass2 KO小鼠和78.6％的WT小鼠發(fā)生了肝腫瘤，盡管在腫瘤發(fā)生率上兩種基因型無明顯差別，但Lass2 KO小鼠的肝腫瘤無論在數(shù)量還是體積上都要顯著高于WT小鼠。生理鹽水組均無肝腫瘤

6、。DEN腹腔注射23w后Lass2 KO小鼠肝組織相對(duì)于WT小鼠，PCNA與EdU實(shí)驗(yàn)顯示高增殖率而TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示低凋亡率。我們發(fā)現(xiàn)組織纖溶酶原激活物抑制劑1型（Plasminogen activator inhibitortype1，PAI-1），一種促癌基因，以及它相關(guān)的基因TGF-β1、Smad4在DEN注射后40w的Lass2 KO小鼠肝中都顯著高于WT小鼠
　　結(jié)論:本研究通過配種獲得的Lass2 KO小鼠確實(shí)為肝定