黃芪甲苷對H2O2誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞系凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡,在各種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。許多研究表明,心肌梗死,心肌病和心肌肥厚的心肌組織中都有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因?yàn)樾募〖?xì)胞的再生能力有限,因此心肌凋亡引起的細(xì)胞損失會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。抑制心肌細(xì)胞凋亡可以防止心力衰竭的發(fā)生。
　　 活性氧(ROS)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌損害。過氧化氫(H2O2)是ROS的主要來源,它可以穿過細(xì)胞膜,擾亂細(xì)胞的天然抗氧化防御系統(tǒng),并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞DNA的損

2、傷。
　　 過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是酶性抗氧化物家族成員,它們在細(xì)胞內(nèi)起到抗氧化作用;它們是細(xì)胞內(nèi)的氧自由基清除劑;它們是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)的一部分。許多研究證實(shí),抗氧化物酶的過表達(dá)可以防止活性氧引起的心肌損傷。
　　 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可被生長因子、氧化應(yīng)激等因素通過PI3K依賴途徑激活。當(dāng)受到各種因素刺激時(shí),膜受體酪氨酸激酶可以激活PI3K,PI

3、3K則將PI(4,5)P2轉(zhuǎn)化為PI(3,4,5)P3,從而激活A(yù)kt?；罨腁kt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程,并與細(xì)胞死亡、黏附、遷移、代謝和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。在心臟中,活化的Akt具有抑制細(xì)胞凋亡和保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。有證據(jù)表明,在用心肌缺血預(yù)處理保護(hù)心臟的缺血/再灌注損傷中,Akt發(fā)揮了重要作用。
　　 Akt可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平,并通過磷酸化調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的活性,而Bcl-2家族蛋白可以直接參與調(diào)控細(xì)

4、胞凋亡。Bcl-2家族的一些成員如Bcl-2和Bcl-xL起到抑制細(xì)胞凋亡作用,而Bad,Bax等則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白可根據(jù)它們的相對含量和磷酸化狀態(tài)而形成同源和/或異源二聚體。有實(shí)驗(yàn)表明,Akt可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),當(dāng)Bcl-2過表達(dá),Bcl-2可以結(jié)合促凋亡蛋白Bax,形成Bcl-2/Bax的異源二聚體,保護(hù)細(xì)胞防止細(xì)胞凋亡。而當(dāng)Bax高表達(dá),游離的Bax蛋白可以形成誘導(dǎo)死亡的同源二聚體,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。B

5、ad是一種促凋亡Bcl-2家族蛋白,它可以取代Bax與Bcl-2形成異源二聚體,使游離出來的Bax得以形成同源二聚體,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bad被磷酸化時(shí),磷酸化的Bad無法再與Bcl-2結(jié)合,遂從Bcl-2異源二聚體中解離,顯示抗細(xì)胞凋亡的作用。研究顯示,無論在體外和體內(nèi),磷酸化的Akt可以使促凋亡蛋白Bad的136位絲氨酸磷酸化并通過抑制細(xì)胞凋亡起到保護(hù)心臟的作用。
　　 黃芪甲苷(ASI)作為一種天然的皂甙,被列在2005年版

6、中國藥典中,可以用來評估植物藥黃芪的質(zhì)量。ASI已被證明具有多種生物及藥理活性,包括抗腫瘤,抗乙肝病毒,抗肝臟纖維化,防治糖尿病并發(fā)癥等作用。最近的研究顯示,ASI有明顯的保護(hù)心臟作用。但是,目前仍沒有關(guān)于ASI是否能夠保護(hù)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究。
　　 目前尚不清楚ASI是否具有抑制活性氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用,本研究的目的是探討ASI是否能抑制H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制。
　　 材料與方法：

7、r>　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):H9c2細(xì)胞(大鼠心肌細(xì)胞系),在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。加入10％胎牛血清和抗生素在37℃,5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2、分組和干預(yù):本研究共分7組,(1)對照組(C組);(2)H2O2組,細(xì)胞暴露于100μM的H2O224小時(shí);(3)、(4)、(5)黃芪甲苷組,黃芪甲苷分別以三種不同的濃度(1,10,20μg/ml)預(yù)處理24小時(shí),然后暴露在100μM的H2O224小時(shí);(6)、(7)組

8、分別將PI3K的特異性抑制劑wortmannin(50 nM)和LY294002(15μM)分別加入到20μg/ml的黃芪甲苷組培養(yǎng)基中。
　　 3、采用MTT法檢測黃芪甲苷及H2O2對H9c2細(xì)胞存活力的影響,在490 nm測定吸光度,無細(xì)胞的孔作為空白對照。
　　 4、采用相應(yīng)的試劑盒來分別檢測LDH,MDA,T-AOC,T-SOD,Gpx,CAT的活性。
　　 5、采用激光共聚焦法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度。<

9、br>　　 6、采用Annexin V-FITC/PI法及Hoechst33258染色法來檢測細(xì)胞的凋亡。
　　 7、采用免疫印跡法檢測Akt,P-Akt(絲氨酸-473),Bad,P-Bad(絲氨酸-136),Bax,Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　 8、采用半定量實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測Akt,Bad,Bax,Bcl-2 mRNA的表達(dá)。
　　 9、所有計(jì)量資料均用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)表示。用統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度的ASI(1、10、20μg/ml)對H9c2細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞存活,呈劑量依賴關(guān)系。
　　 2、不同濃度的H2O2(10、50、100、200、400μM)對H9c2作用24小時(shí)細(xì)胞存活率呈劑量依賴性降低。用100μM的H2O2作用不同時(shí)間(12、24、36、48、60小時(shí))導(dǎo)致H9c2細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性降低。

11、
　　 3、不同濃度ASI(1、10、20μg/ml)預(yù)處理可以減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷,隨著ASI濃度的增加,相應(yīng)的MTT法檢測的OD值也隨之增加。
　　 4、在H2O2作用后心肌細(xì)胞受到損傷,LDH和MDA的濃度均較C組明顯增高,抗氧化酶活性較C組明顯降低,細(xì)胞總抗氧化性明顯下降。ASI(1,10,20μg/ml)預(yù)處理培養(yǎng)細(xì)胞,在H2O2損傷過程中,均較H2O2組細(xì)胞損傷減小,LDH和MDA濃度明顯減少,

12、而抗氧化酶活性和細(xì)胞總抗氧化性較H2O2組明顯增加。
　　 5、經(jīng)H2O2處理24小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),不同的濃度ASI(1、10、20μg/ml)預(yù)處理24小時(shí)后,與H2O2組相比細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯下降并呈濃度依賴性。
　　 6、在熒光顯微鏡下,對照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,染色均勻并呈現(xiàn)藍(lán)色淡染,H2O2組見細(xì)胞核大量致密濃染、顏色白亮的凋亡細(xì)胞。經(jīng)不同濃度ASI處理后,致密濃染、顏色白亮的細(xì)胞核逐漸減

13、少,并呈劑量相關(guān)性。
　　 7、采用Annexin FITC/PI法檢測心肌細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示:H2O2組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于C組;與H2O2組比較,ASI(1、10、20μg/ml)組細(xì)胞凋亡率明顯降低,且隨著ASI劑量的增加,凋亡率逐漸下降。
　　 8、Western blotting結(jié)果顯示:H2O2作用24小時(shí)后,Akt在各組中都有表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達(dá)量較C組明顯

14、減少,Bax蛋白表達(dá)量較C組明顯增加,差異具有顯著性。ASI(1、10、20μg/ml)呈劑量依賴性增加p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá),差異有顯著性。Wortmannin和LY294002預(yù)處理可以拮抗ASI的部分保護(hù)作用。
　　 9、Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:H2O2作用24小時(shí)后,Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達(dá)均較C組明顯減少,Bax mRNA表達(dá)則較C組明顯增加；

15、ASI(1、10、20μg/ml)呈劑量依賴性增加Akt,Bad,Bcl-2 mRNA的表達(dá),降低Bax mRNA的表達(dá),與H2O2組比較差異有顯著性。LY294002和wortmannin預(yù)處理可以拮抗ASI的部分保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、ASI對H9c2細(xì)胞存活率的影響具有時(shí)間和劑量依賴性。
　　 2、ASI通過降低MDA,增加抗氧化物酶活性,提高總抗氧化能力來減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。