魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、1魚藤酮致PC12細(xì)胞線粒體功能及超微結(jié)構(gòu)的影響 目的：線粒體是動(dòng)物細(xì)胞能量代謝的主要場(chǎng)所，線粒體功能障礙在帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。魚藤酮，一種親脂性殺蟲劑，是線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，本部分實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)魚藤酮對(duì)細(xì)胞活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，線粒體跨膜電位(用△Ψm表示)及其超微結(jié)構(gòu)的影響，擬探討魚藤酮損害線粒體的可能機(jī)制。 結(jié)果

2、：0.1、1.0、2.0和3.0μmol/L不同濃度魚藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，其熒光強(qiáng)度值分別為：1.55±0.17、2.16±0.10、1.77±0.20和1.41±0.12，相同濃度魚藤酮干預(yù)可損壞△Ψm，其熒光強(qiáng)度分別為：93.86±10.12、119.43±7.09、102.71±9.36和83.14±10.70，分別與各自的對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)，以上實(shí)驗(yàn)組中以1.0μmol/L魚藤酮作用最顯著(P＜0.01

3、)。當(dāng)魚藤酮濃度大于1.0μmol/L時(shí)，其作用呈現(xiàn)劑量依賴性遞減。電鏡下觀察到多數(shù)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，表現(xiàn)為：局部水腫、部分線粒體嵴排列紊亂，線粒體髓樣變及空泡樣變性等。 結(jié)論：魚藤酮通過誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生大量ROS、破壞線粒體跨膜電位以及引起線粒體超微結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而參與PD的病理過程。 2魚藤酮誘發(fā)PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的鈣機(jī)制和超微結(jié)構(gòu)的變化 目的：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic

4、reticulum，ER)是一類具有多種功能的信號(hào)細(xì)胞器，脂質(zhì)合成、鈣離子貯存、蛋白質(zhì)的折疊與加工等重要生理活動(dòng)都在ER腔中進(jìn)行，并通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但是，ER對(duì)應(yīng)激極其敏感，鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂、未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集在ER腔均可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本部分實(shí)驗(yàn)主要探討魚藤酮誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的鈣離子機(jī)制及其超微結(jié)構(gòu)變化的機(jī)制。 結(jié)果：0.1、1.0、2.0和3.0μmol/L不同濃度魚藤酮可誘導(dǎo)細(xì)胞ER鈣庫釋放鈣

5、離子，細(xì)胞內(nèi)鈣離子發(fā)生變化，單細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化率經(jīng)平方根反正弦變換值分別為：0.6029±0.0685、1.0902±0.1127、0.7479±0.0820和0.5614±0.0870，分別與對(duì)照組比較差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。當(dāng)魚藤酮濃度大于1.0μmol/L時(shí)，呈現(xiàn)劑量依賴性遞減。預(yù)先加入超氧歧化酶(superoxidedismutase，SOD)1200U/ml干預(yù)24h后，可有效減弱1.0μmol/L魚藤酮引發(fā)

6、細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高(P＜0.01)。電鏡下觀察到ER超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為：滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量增生，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕、中度擴(kuò)張及脫顆粒。 結(jié)論：魚藤酮通過耗竭ER腔鈣離子，誘發(fā)ER應(yīng)激，并受氧化應(yīng)激調(diào)控；魚藤酮亦引起ER超微結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化，說明ER應(yīng)激是魚藤酮發(fā)揮毒性作用的重要途徑之一。 3魚藤酮下調(diào)PC12細(xì)胞GM130蛋白的凋亡機(jī)制及高爾基體超微結(jié)構(gòu)的改變 目的：高爾基復(fù)合體(golgicomplex，GC)是細(xì)胞內(nèi)

7、的小細(xì)胞器，其功能相當(dāng)復(fù)雜即具備修飾、分選和水解、加工蛋白質(zhì)的功能，又具有轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌物質(zhì)的作用。GC由順面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(cisGolginetwork，CGN)，高爾基中間膜囊(MedialGolgistack，MGS)和反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(transGolginetwork，TGN)三部分組成。GM130是一種130kDa順面高爾基基質(zhì)蛋白(cis-Golgimatrixprotein)，被視為CGN的一部分，在維持CGN結(jié)構(gòu)方面發(fā)

8、揮重要作用。本部分實(shí)驗(yàn)主要探討魚藤酮通過激活Fas/Fasl凋亡途徑對(duì)GM130蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，并觀察GC超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：用熒光指數(shù)(FI)表示Fas/Fasl蛋白的表達(dá)，對(duì)照組：Fas為1.00±0.02，F(xiàn)asl為1.00±0.04；加入魚藤酮1.0μmol/L干預(yù)3、6、12、24和48h，F(xiàn)as的FI值分別為：1.12±0.03、1.29±0.08、1.11±0.07、1.11±0.04和0.90±0

9、.07，實(shí)驗(yàn)組中以魚藤酮干預(yù)6h和48h時(shí)Fas表達(dá)明顯，與對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.01、P＜0.01)；而Fasl的FI值分別為：1.01±0.08、1.35±0.20、1.19±0.08、1.05±0.04和1.04±0.03；實(shí)驗(yàn)組中以魚藤酮干預(yù)6h時(shí)Fasl表達(dá)最明顯(P＜0.01)，與對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.16、P=0.0047)，F(xiàn)asl表達(dá)趨勢(shì)與Fas比較

10、一致。GM130陽性表達(dá)為細(xì)胞漿著染棕色，對(duì)照組GM130灰度值為115.75±9.98，加入0.1、1.0、2.0和3.0μmol/L不同濃度魚藤酮干預(yù)16h后，其灰度值分別為129.38±4.03、162.00±8.75、144.13±6.10和135.50±6.00，與對(duì)照組比較差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其中以1.0μmol/L魚藤酮組作用最明顯(P＜0.01)。當(dāng)魚藤酮濃度大于1.0μmol/L時(shí)，其作用呈現(xiàn)劑量依

11、賴性遞減。電鏡下觀察到高爾基復(fù)合體消失。 結(jié)論：魚藤酮可通過激活Fas/Fasl調(diào)亡途徑，下調(diào)GM130蛋白的表達(dá)，并損傷高爾基復(fù)合體。 4魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞Caspase-3，F(xiàn)as和Fasl的作用及與凋亡關(guān)系 目的：神經(jīng)元細(xì)胞的退變可以通過壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種途徑實(shí)現(xiàn)，氧化自由基的各種化合物、線粒體功能損傷、興奮性神經(jīng)毒作用和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的異常操作都可改變凋亡細(xì)胞調(diào)節(jié)的平

12、衡，介導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的丟失。因此，本部分實(shí)驗(yàn)主要探討魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞Caspase-3蛋白酶及Fas/Fasl途徑的作用及與凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究。 結(jié)果：用熒光指數(shù)(FI)表示Caspase-3、Fas/Fasl的表達(dá)。各組均有Caspase-3表達(dá)，對(duì)照組為1.00±0.03，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)1.0μmol/L魚藤酮干預(yù)3、6、12、24和48h，其FI值分別為：1.61±0.19、1.87±

13、0.06、2.60±0.16、1.75±0.07和1.42±0.09，與對(duì)照組比較具有顯著差異(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組中以魚藤酮干預(yù)12h時(shí)Caspase-3表達(dá)最明顯(P＜0.01)；魚藤酮干預(yù)24h，Caspase-3的表達(dá)分別與3、6h的比較不具有顯著差異(P＞0.05)；魚藤酮干預(yù)3h時(shí)Caspase-3的表達(dá)與48h的比較差別亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外，各組均有Fas表達(dá)，對(duì)照組為1.00±0.02，經(jīng)1.0μmol

14、/L魚藤酮干預(yù)3、6、12、24和48h，其FI值分別為：1.12±0.03、1.29±0.08、1.11±0.07、1.11±0.04和0.90±0.07，實(shí)驗(yàn)組中以魚藤酮干預(yù)6和48h時(shí)Fas表達(dá)明顯，與對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組比較具有顯著差異(P＜0.01)。Fas配體在各組中亦有表達(dá)，對(duì)照組為1.00±0.04，同樣魚藤酮干預(yù)后其FI值分別為：1.01±0.08、1.35±0.20、1.19±0.08、1.05±0.04和1.04±0

15、.03；實(shí)驗(yàn)組中以魚藤酮干預(yù)6h時(shí)Fasl表達(dá)最明顯，與對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組比較具有顯著差異(P=0.0047)，F(xiàn)asl表達(dá)趨勢(shì)與Fas比較一致。凋亡率結(jié)果：對(duì)照組為0.0199±0.0020，經(jīng)0.1、1.0、2.0和3.0mol/L不同濃度魚藤酮干預(yù)3d，凋亡率明顯增加分別為：0.0336±0.0027、0.0404±0.0023、0.0389±0.0023、和0.0339±0.0032，分別與對(duì)照組比較具有顯著差異(P＜0.01)

16、。同樣，經(jīng)相同濃度魚藤酮干預(yù)2d，凋亡率亦明顯增加分別為：0.0305±0.0030、0.0486±0.0073、0.0313±0.0041和0.0285±0.0031，其中在α=0.05水準(zhǔn)下，0.1、2.0、3.0μmol/L兩兩之間比較不具有顯著差別(P＞0.05)，其余任兩組比較均有顯著差別(P＜0.01)。在不同濃度魚藤酮作用下，PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)變化，其表現(xiàn)特征并不一致，而且細(xì)胞對(duì)魚藤酮毒性作用的反應(yīng)存在差異，鏡下觀

17、察到有的細(xì)胞表現(xiàn)為：細(xì)胞膜整齊，細(xì)胞周圍有小的突起，可能是微絨毛，核質(zhì)比增高，內(nèi)外核膜均勻，常染色質(zhì)豐富，說明細(xì)胞的生命活動(dòng)比較旺盛。而有的細(xì)胞則表現(xiàn)為：細(xì)胞膜不光滑，細(xì)胞突起減少，核質(zhì)比小，細(xì)胞質(zhì)空間增大，核周隙增大、不規(guī)則，異染色質(zhì)增多、邊集，說明細(xì)胞正處在凋亡過程中。 結(jié)論：魚藤酮可激活Caspase-3、Fas/Fasl凋亡途徑參與PC12細(xì)胞的凋亡過程，非特征性凋亡形態(tài)學(xué)的改變亦證實(shí)凋亡機(jī)制是魚藤酮發(fā)揮毒性作用的重要途