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文檔簡介
1、背景:乳腺癌是威脅女性生存的主要腫瘤之一。NGAL為lipocalin蛋白家族的新成員,具有典型的β折疊桶狀保守結構,是一種25kD的分泌型糖蛋白。因其結合配體的多樣性,NGL在諸如細胞生長、分化、腫瘤遷移與侵襲以及EMT轉變等眾多生理與病理學過程中扮演著重要的角色。大量研究結果表明NGAL是一種新的腫瘤標志物,為潛在的腫瘤治療靶點。NGAL的生物學功能及其表達調控模式因腫瘤種類及其分型而有所不同。研究表明在乳腺癌中NGAL的表達亦與乳
2、腺癌種類及亞型有關,其表達受雌激素受體ER以及轉錄因子NFAT的調控。在機體內部基因表達調控是一個十分復雜的過程,NGAL在腫瘤細胞內表達的異質性正顯示了基因表達調控的復雜性。C/EBPζ為C/EBP家族轉錄因子成員,對C/EBP家族其他成員的轉錄調控活性起著負調控的作用。已有研究表明在白血病等腫瘤中C/EBPζ表達明顯降低。結合文獻以及生物信息學分析我們在NGAL的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了潛在的C/EBPζ作用位點,但C/EBPζ是否參與NGA
3、L的表達調控尚不明確。鈉氫交換體1(NHE1,Na+/H+exchanger1)對細胞的pHi起著重要的調節(jié)作用,腫瘤細胞內的堿化作用是腫瘤進程中的標志性事件之一。NHE1介導的腫瘤細胞內pHi升高是否對乳腺癌細胞內C/EBPζ以及NGAL的表達具有調控作用仍不明了。
目的:以ER受體陰性、具高侵襲能力的乳腺癌MDA-MB-231細胞株為研究對象,分析轉錄因子C/EBPζ以及NGAL基因在其轉移中的生物學作用及其機制。在此
4、基礎上闡明NHE1以及C/EBPζ對NGAL基因的調控機制。
方法:采用實時定量PCR、western blotting技術檢測NGAL在遷移能力不同的細胞系中的差異性表達;通過過表達轉錄因子C/EBPζ以及基因沉默技術干擾NGAL基因分別研究C/EBPζ以及NGAL在乳腺癌轉移中的生物學作用。酶譜法檢測過表達C/EBPζ以及干擾NGAL后MMPs蛋白活性的改變。構建NGAL啟動子的熒光素酶報告質粒,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)
5、研究C/EBPζ以及NHE1對NGAL轉錄的調控。采用WNT以及NF-κB通路的抑制劑分析了相關信號通路在NGAL介導的腫瘤細胞轉移中的生物學作用。
結果:相比低遷移能力的ER+的乳腺癌細胞系MCF7,MDA—MB-231細胞系中NGAL基因的表達顯著升高,顯示了NGAL對轉移能力的潛在調控。過表達C/EBPζ以及干擾NGAL基因后MDA-MB-231細胞的轉移能力明顯受到抑制,細胞的MMPs家族蛋白的表達及其活性均受到影
6、響。雙熒光素酶報告實驗證實C/EBPζ對NGAL基因啟動子的活性有明顯的調節(jié)作用。采用NHE1的選擇性抑制劑Cariporide抑制其活性后,MDA-MB-231細胞的侵襲能力受到明顯抑制。雙熒光素酶報告實驗證實這種抑制作用部分源于C/EBPζ升高所引起NGAL表達降低來完成的。
結論:C/EBPζ通過調節(jié)NGAL啟動子的轉錄活性來抑制NGAL的表達,進而實現(xiàn)其對MDA—MB-231細胞轉移能力的調控。NHE1以及基質金屬
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