“PQRSPT”基序在人B7-H3基因生物學(xué)功能中的分子機(jī)制研究.pdf

1、T細(xì)胞的有效活化需要雙信號(hào),其中共刺激分子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用,B7-H3是共刺激分子B7家族成員之一。人B7-H3有兩種不同形式的剪切體:2IgB7-H3和4IgB7-H3。2IgB7-H3胞外段由IgV-IgC兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成,而4IgB7-H3胞外段由IgV1—IgC1-IgV2-IgC2四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)4IgB7-H3是人各組織細(xì)胞中B7-H3的主要表達(dá)形式,目前仍缺乏對(duì)兩種剪切體的差異研究

2、。許多共刺激分子分別以細(xì)胞膜型和可溶型兩種形式存在。本實(shí)驗(yàn)室在健康人外周血和組織液中發(fā)現(xiàn)存在天然形式的sB7-H3,且發(fā)現(xiàn)sB7-H3僅源于2IgB7-H3。基因序列研究發(fā)現(xiàn)4IgB7-H3胞外段4個(gè)結(jié)構(gòu)域是由編碼2IgB7-H3 IgV和IgC外顯子復(fù)制的結(jié)果,2IgB7-H3和4IgB7-H3兩種剪切體的同源性超過95％,本研究通過氨基酸序列比對(duì)和分析,發(fā)現(xiàn)在人4IgB7-H3分子第一個(gè)C樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域碳端末端存在一段獨(dú)特的氨基

3、酸序列為“PQRSPT”,其在2IgB7-H3分子序列中缺失。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)獲得了增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因和缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因,并構(gòu)建相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,以此來探討“PQRSPT”基序在人B7-H3基因生物學(xué)功能及可溶性B7-H3產(chǎn)生過程中的分子機(jī)制。
　　 ㈠2IgB7-H3-Add與4IgB7-H3-Del基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立。RT-PCR法分別擴(kuò)增2I

4、gB7-H3與4IgB7-H3編碼區(qū)全長(zhǎng)基因,并通過拼接PCR的方法獲得增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因和缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因。將兩個(gè)目的基因片段雙酶切后與pIRES20EGFP真核表達(dá)載體連接,構(gòu)建重組子pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-Add和pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-Del,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將兩個(gè)重組載體分別導(dǎo)入小鼠L929細(xì)胞。RT-

5、PCR結(jié)果表明表明導(dǎo)入的外源性2IgB7-H3-Add和4IgB7-H3-Del基因已分別成功整合到L929細(xì)胞基因組中并能成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GFP和B7-H3蛋白在兩株細(xì)胞表面均穩(wěn)定高表達(dá)；Western Blot分析結(jié)果顯示L929/2IgB7-H3-Add和L929/4IgB7-H3-Del細(xì)胞均能成功表達(dá)B7-H3蛋白。
　　 ㈡“PQRSPT”基序在人B7-H3基因生物學(xué)功能中的分子機(jī)制研究。收集上

6、述基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA和Western Blot分析,結(jié)果顯示在2IgB7-H3和4IgB7-H3-Del基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在可溶性B7-H3蛋白,而4IgB7-H3和2IgB7-H3-Add基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清與對(duì)照組一樣,都未檢測(cè)出可溶性形式的存在。該研究結(jié)果表明保守性氨基酸“PQRSPT”可能是人4IgB7-H3不能形成可溶性形式的一個(gè)重要基序。同時(shí),基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與外周血T細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及分泌細(xì)

7、胞因子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),2IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著地促進(jìn)T細(xì)胞體外增殖與細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,相比之下,增加“PQRSPT”基序的2IgB7-H3-Add基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無此效應(yīng):4IgB7-H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著抑制T細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,而缺失“PQRSPT”基序的4IgB7-H3-Del基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無明顯作用。以上研究結(jié)果均證實(shí)“PQRSPT”基序可能是4IgB7-H3分子中的功能

8、結(jié)構(gòu)域,且對(duì)B7-H3生物學(xué)功能的改變具有重要作用。
　　 ㈢本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了L929/2IgB7-H3-Add和L929/4IgB7-H3-Del兩株轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,對(duì)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)上清中sB7-H3的檢測(cè)結(jié)果表明了“PQRSPT”基序與人4IgB7-H3分子不能分泌可溶性形式密切相關(guān)。T細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示,兩株基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞均對(duì)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌無效應(yīng),表明“PQRSPT”基序可能是4IgB7-H3分子發(fā)揮抑制作用