小鼠原始生殖細(xì)胞在生殖嵴的定位及其與豬原始生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng).pdf

1、原始生殖細(xì)胞(PGCs)的發(fā)育與遷移，是哺乳動物配子發(fā)生和發(fā)育生物學(xué)的基本問題之一。PGCs的分離培養(yǎng)，對胚胎生殖(EG)細(xì)胞的建系是至關(guān)重要的。由于EG細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、分子標(biāo)志與體內(nèi)外分化潛能等方面都與ES細(xì)胞相似，并被證實具有種系傳遞能力，因此，分離培養(yǎng)PGCs已經(jīng)成為獲得多能干細(xì)胞的一條重要途徑。本研究以小鼠、豬胚胎為材料，對不同胚齡小鼠生殖嵴的發(fā)育進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較研究，通過對PGCs在生殖嵴中的AP染色定位觀察，比較其數(shù)量的增殖規(guī)律

2、；通過采集不同日齡昆明小鼠PGCs，探討并優(yōu)化其分離培養(yǎng)程序；并從豬胚胎生殖嵴中分離PGCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)與傳代，對影響PGCs分離和培養(yǎng)的因素進(jìn)行探討。本研究包括如下試驗：試驗1小鼠胚胎不同發(fā)育階段生殖嵴的形態(tài)學(xué)研究本試驗以昆明小鼠胚胎為材料，對不同胚齡的生殖嵴進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較研究，通過對PGCs在生殖嵴中的AP染色定位觀察，比較其數(shù)量的增殖規(guī)律，以期為小鼠EG細(xì)胞的分離培養(yǎng)提供依據(jù)。試驗表明，小鼠11.5～13.5dpc胚胎，隨胎齡增

3、長生殖嵴的形態(tài)發(fā)生明顯變化，由凸入體腔的原始性索漸變?yōu)闄E圓形的實質(zhì)性器官-性腺；AP染色表明，在這個過程中，生殖嵴內(nèi)的PGCs在不同胎齡的生殖嵴內(nèi)，數(shù)量明顯不同，顯示出隨著胎齡增長，呈數(shù)量級增殖的趨勢。小鼠11.5～12.5dpc胚胎為采集PGCs的最佳時期。試驗2小鼠原始生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)本試驗分離培養(yǎng)10.5～14.5dpc小鼠胚胎的PGCs，對PGCs的形態(tài)特征、體外生長特性進(jìn)行了探索。試驗表明：(1)對PGCs進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明

4、分離的PGCs呈圓形或橢圓形，邊緣光滑，具有折光性，AP染色呈強陽性。(2)10.5～13.5dpc的PGCs在培養(yǎng)5d后，集落出現(xiàn)高峰期。13.5dpc的PGCs，在培養(yǎng)3d后集落的增殖逐漸平緩；14.5dpc的PGCs則在培養(yǎng)3d后集落數(shù)出現(xiàn)下降?？傮w來看，11.5和12.5dpc小鼠胚胎PGCs，最適于分離培養(yǎng)胚胎生殖(EG)細(xì)胞。(3)通過對分離培養(yǎng)的EG細(xì)胞集落進(jìn)行鑒定，表明其形態(tài)學(xué)特征和AP活性與小鼠ES細(xì)胞相似；本試驗以S

5、TO細(xì)胞作飼養(yǎng)層，分離培養(yǎng)小鼠EG細(xì)胞，并傳至第8代。(4)從傳代培養(yǎng)結(jié)果來看，采集10.5～12.5dpc胚胎生殖嵴，不僅可獲得相當(dāng)數(shù)量的PGCs，集落生長也相對穩(wěn)定。試驗3豬原始生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)本試驗采集妊娠25～27d豬胚胎的PGCs，以STO細(xì)胞作飼養(yǎng)層，用96孔培養(yǎng)板作原代培養(yǎng)，4孔培養(yǎng)板作傳代培養(yǎng)。結(jié)果表明：(1)對分離培養(yǎng)的豬EG細(xì)胞集落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和AP染色，表明所分離的5～6代EG細(xì)胞集落形態(tài)與小鼠ES細(xì)胞類似。豬