結(jié)核分支桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達(dá)基因研究.pdf

1、目的：構(gòu)建結(jié)核分支桿菌H37Rv與H37Ra的差異表達(dá)基因消減文庫(kù),分離結(jié)核分支桿菌差異表達(dá)cDNA片段并分析其功能,篩選出致病株獨(dú)有的保護(hù)性抗原編碼基因,借助質(zhì)粒載體將其表達(dá)于人類口腔非致病性黏膜共生菌戈登氏鏈球菌表面,為構(gòu)建新型結(jié)核黏膜疫苗打下基礎(chǔ)。本研究分為五部分：結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)；結(jié)核分支桿菌RNA抽提及純化；抑制性消減雜交；cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建；消減文庫(kù)的擴(kuò)增及鑒定及測(cè)序。
　　 方法：⑴利用法國(guó)梅里埃公司BacT

2、ALERT()MP處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)核分支桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra進(jìn)行快速液體培養(yǎng)。⑵按Trizol試劑盒及TaKaRa公司PCR Product Purification Kit說明書操作進(jìn)行結(jié)核分支桿菌RNA抽提及純化。⑶利用抑制性消減雜交技術(shù)分析結(jié)核分支桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37R的基因組mRNA的表達(dá)差異,并進(jìn)行兩輪消減雜交和兩次PCR。⑷:將第二次PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體相連,電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌coli DH

3、5a,離心轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,取沉淀涂于藍(lán)白斑篩選平板,構(gòu)建正相和反相消減文庫(kù)A庫(kù)和B庫(kù)。⑸隨機(jī)挑取A庫(kù)和B庫(kù)白色菌落作為RT-PCR模版進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增和藍(lán)白斑篩選,RT-PCR鑒定差異表達(dá)文庫(kù)。⑹隨機(jī)挑選含有插入序列的陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序并進(jìn)行序列分析。所得測(cè)序結(jié)果通過NCBI提供的Blast軟件與GenBank收錄的序列進(jìn)行同源性比較,查閱文獻(xiàn),分析結(jié)果。
　　 結(jié)果：以結(jié)核分支桿菌強(qiáng)毒株H37RV的cDNA為檢測(cè)子的正相雜交和以弱毒

4、株H37Ra的cDNA為檢測(cè)子的反相雜交各自高表達(dá)或特異性表達(dá)的片斷都得到選擇性擴(kuò)增,成功構(gòu)建了差異表達(dá)cDNA文庫(kù)A庫(kù)和B庫(kù)。所長(zhǎng)出的菌落中90％為白色克隆,其中A庫(kù)單一條帶的克隆為75％,B庫(kù)為80％,片斷大小集中在100-800bp之間。分別從A庫(kù)和B庫(kù)中各自篩選出一批克隆,送上海生工進(jìn)行測(cè)序,正相雜交篩選到11個(gè)特異性序列,反相雜交未篩選到特異性序列:其中1個(gè)為PPE家族蛋白,1個(gè)編碼已知的毒力因子mce蛋白,1個(gè)存在6000早

5、期分泌抗原(ESAT-6)的基因序列,1個(gè)編碼膜蛋白,6個(gè)分別編碼亮氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、短鏈還原酶、核糖核苷二磷酸還原酶、甲基分支菌酸合酶、異亮氨酰-tRNA合成酶,1個(gè)為可能蛋白。其中PPE、ESAT-6為結(jié)核分支桿菌的保護(hù)性抗原。
　　 結(jié)論：利用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了結(jié)核分支桿菌強(qiáng)毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差異表達(dá)基因消減cDNA文庫(kù),并篩選到這兩種菌株間的差異基因。SSH用于比較強(qiáng)毒、弱毒微生物基因組間差異進(jìn)