胰高血糖素受體的生物化學(xué)及生物物理特性分析——胞外區(qū)的重組表達(dá)、結(jié)晶篩選和功能測(cè)定.pdf

1、胰高血糖素(Glucagon，Gc)是人體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖濃度的重要肽類激素之一，其主要生理作用是通過調(diào)節(jié)糖異生和糖原分解來升高血糖。胰高血糖素的受體(Glucagon receptor，GCGR)在人體各種組織器官中廣泛分布，但主要位于肝細(xì)胞膜表面，是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)超家族中家族B的典型代表，屬于七次跨膜蛋白，其胞外區(qū)(Extracelluar domain，ECD)是與胰高血

2、糖素結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域。現(xiàn)在有很多研究認(rèn)為人體內(nèi)胰高血糖素濃度過高是促使糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素，甚至被認(rèn)為是2型糖尿病病理生理過程中的中心環(huán)節(jié)。已經(jīng)在糖尿病動(dòng)物模型中證實(shí)胰高血糖素受體的拮抗性抗體或小分子可以明顯降低血糖濃度，因此拮抗胰高血糖素的作用可能成為治療2型糖尿病的新領(lǐng)域。獲得胰高血糖素受體與其配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息，不僅可以揭示這類重要受體發(fā)揮功能的分子機(jī)制，更加有助于我們更好地設(shè)計(jì)出合理的藥物，應(yīng)用于糖尿病及其他代謝病的治療。因

3、此，我們期望可以解析胰高血糖素受體胞外區(qū)(GCGR-ECD)及其與胰高血糖素結(jié)合的結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
　　在本論文中，作者綜合運(yùn)用了各種表達(dá)及純化手段，嘗試了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。最終在大腸桿菌Origami B宿主菌中純化出MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白，Maltose binding protein)融合的GCGR-ECD重組蛋白，并且創(chuàng)新性的將胰高血糖素小肽融合在此蛋白的羧基末端(命名為GC GR-EC D-

4、Gc)，使Glucagon可在分子內(nèi)部與GCGR-ECD結(jié)合。另一方面，作者在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中分泌性表達(dá)了GCGR-ECD，并篩選出了一種可以大大提高蛋白表達(dá)量的信號(hào)肽。作者第一次在體外應(yīng)用等溫量熱滴定法（Isothermal titration calorimetry，ITC）檢測(cè)了重組GCGR-ECD蛋白與胰高血糖素的結(jié)合力，原核表達(dá)蛋白的平衡解離常數(shù)值(Kd)為7.6μM，真核蛋白則為6.6μM，并用ITC證明了MBP融合的GCGR

5、-ECD-G-c蛋白可以在分子內(nèi)部形成受體-配體的結(jié)合，是進(jìn)行下一步X射線晶體學(xué)研究的良好對(duì)象。
　　作者通過各種生物物理方法檢測(cè)了各類重組蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及穩(wěn)定性，并大量嘗試了結(jié)晶篩選。雖然結(jié)晶實(shí)驗(yàn)沒有成功，但作者發(fā)現(xiàn)這類重組蛋白結(jié)晶困難的主要因素。最后，作者提出了可能的改進(jìn)方法以及手段，可供后續(xù)研究參考。
　　本論文在闡述GCGR-ECD的研究之后總結(jié)了目前GPCR研究領(lǐng)域的進(jìn)展，包括GPCR的最新研究方法，以及各類