結(jié)直腸癌IGFBP7基因異常甲基化的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在西方經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌的死亡率位于惡性腫瘤的第二位；在我國(guó)，其死亡率位于第四位左右。近二十年來(lái)，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率總體上呈上升趨勢(shì)，并且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率還會(huì)繼續(xù)上升。盡管相對(duì)于其它腫瘤而言，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究得比較深入，但其診治方法仍未獲突破性進(jìn)展，進(jìn)展期結(jié)直腸癌的五年生存率仍未得到根本性提高，因此積極開(kāi)展結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于結(jié)直腸癌的防治具有很

2、重要的現(xiàn)實(shí)意義。 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7(insulin-likegrowthfactorbindingprotein7，IGFBP7)基因是我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)抑制性差減雜交法從結(jié)腸腺癌-正常粘膜的差減cDNA文庫(kù)中篩出并在結(jié)腸腺癌中高表達(dá)的一個(gè)基因。IGFBP7在人體內(nèi)多種組織、器官中廣泛表達(dá)，但在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如乳腺癌、腦膜瘤、肝癌、前列腺癌等。IGFBP7在結(jié)直腸癌中的相關(guān)研究不多。現(xiàn)有的文獻(xiàn)均支持IGFBP7在

3、結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較正常組織更高，但在絕大多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失。IGFBP7在體內(nèi)、外結(jié)直腸癌細(xì)胞及在不同腫瘤組織中的差異表達(dá)提示，很可能存在一個(gè)可逆的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)。因此，深入開(kāi)展結(jié)直腸癌IGFBP7表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，將有助于進(jìn)一步明確IGFBP7在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療提供切入點(diǎn)。 基因的表達(dá)調(diào)控主要通過(guò)遺傳學(xué)(genetics)和表遺傳學(xué)(epigenetics)兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)

4、。遺傳學(xué)機(jī)制只能解釋腫瘤發(fā)病機(jī)制中的一部分原因，還有許多具有重要功能的基因是通過(guò)表遺傳學(xué)機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表遺傳學(xué)改變是一種不涉及核苷酸序列變化的可遺傳的基因表達(dá)方式的改變。DNA甲基化是其中研究得最深入的作用方式，與抑制基因的表達(dá)有關(guān)。DNA異常甲基化的檢測(cè)已成為研究腫瘤發(fā)生機(jī)制的分子熱點(diǎn)之一。但目前對(duì)甲基化的研究局限于CpG島中少數(shù)幾個(gè)CG位點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)整個(gè)5'端CpG島甲基化狀態(tài)篩選表達(dá)調(diào)控相關(guān)的甲基化熱點(diǎn)或區(qū)段的研究則鮮

5、有報(bào)道。 與遺傳學(xué)改變不同的是，表遺傳學(xué)是一個(gè)可逆的化學(xué)修飾過(guò)程，因此可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。例如，使用去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase1，DNMT1)的活性，使因甲基化而表達(dá)抑制的基因恢復(fù)表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型。 本課題的目的是研究IGFBP7基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)

6、闡明5'端CpG島異常甲基化對(duì)IGFBP7基因表達(dá)調(diào)控的影響。我們采用RT-PCR法檢測(cè)IGFBP7基因在本實(shí)驗(yàn)室保存的10個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株中mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)僅SW480和Caco2表達(dá)IGFBP7，而SW620、Hce8693、CW2、COLO205、HT29、HCT8、SW1116和RKO等8個(gè)細(xì)胞株中檢測(cè)不到IGFBP7表達(dá)。對(duì)10個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株IGFBP7基因的啟動(dòng)子序列和所有5個(gè)外顯子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果顯示，SW

7、480和SW620在啟動(dòng)子區(qū)域-181位存在G/A變化，Caco2和COLO205在第一外顯子+53位存在C/T變化，經(jīng)NCBI檢索發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)位點(diǎn)均是單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)IGFBP7的重要生物學(xué)功能有影響。由于IGFBP7在SW480和Caco2中表達(dá)陽(yáng)性，而在SW620和COLO205中表達(dá)陰性，這兩個(gè)位點(diǎn)的堿基改變應(yīng)與基因表達(dá)

8、關(guān)系不大。上述研究結(jié)果提示，遺傳學(xué)改變(核苷酸序列變化)可能不是IGFBP7基因表達(dá)調(diào)控的主要機(jī)制。因此，有必要對(duì)表遺傳學(xué)改變?cè)贗GFBP7表達(dá)調(diào)控中所起的作用進(jìn)行研究。 在線(xiàn)軟件分析結(jié)果顯示IGFBP7基因的5'端有一個(gè)CpG島，長(zhǎng)約1200bp，覆蓋啟動(dòng)子區(qū)域、第一外顯子和部分第一內(nèi)含子序列。該CpG島含有135個(gè)CpG位點(diǎn)，這些CpG位點(diǎn)的異常甲基化都可能參與IGFBP7基因的表達(dá)調(diào)控。因此，我們首先采用亞硫酸氫鈉-測(cè)序P

9、CR法(bisulfitesequencingPCR，BSP)對(duì)該基因5'端CpG島中所有CpG位點(diǎn)的甲基化情況進(jìn)行檢測(cè)。為尋找與基因表達(dá)相關(guān)的甲基化特異性區(qū)段，對(duì)所獲得的10個(gè)細(xì)胞株IGFBP7基因5'端CpG島中135個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示，IGFBP7基因第一外顯子在IGFBP7表達(dá)陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞株之間存在顯著的甲基化差異(P＜0.05)，而啟動(dòng)子區(qū)序列和第一內(nèi)含子序列的甲基化情況在IGFBP7表達(dá)陽(yáng)性與

10、陰性的細(xì)胞株間差別不明顯，提示第一外顯子的異常甲基化很可能與表達(dá)關(guān)系密切。根據(jù)這一結(jié)果，我們?cè)贗GFBP7第一外顯子區(qū)域進(jìn)行甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測(cè)。結(jié)果顯示，IGFBP7第一外顯子CpG島序列在IGFBP7表達(dá)陽(yáng)性的SW480和Caco2細(xì)胞中未甲基化，而在IGFBP7表達(dá)陰性的的其余幾個(gè)細(xì)胞株中則發(fā)生甲基化改變(完全甲基化或部分甲基化)。IGFBP7基因在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

11、與其第一外顯子的甲基化水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。 為進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化是結(jié)腸癌IGFBP7基因表達(dá)調(diào)控的直接機(jī)制，我們用去甲基化藥物5-aza-dC處理結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、COLO205和HT29，分別采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)藥物處理前后結(jié)腸癌細(xì)胞中IGFBP7mRNA和蛋白表達(dá)，MSP法檢測(cè)IGFBP7基因第一外顯子甲基化狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示，5-aza-dC處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞中IGFBP7mRNA和蛋白均恢

12、復(fù)表達(dá)，MSP法檢測(cè)證實(shí)該基因發(fā)生了去甲基化改變，提示IGFBP7在這些結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)的恢復(fù)是該基因去甲基化的直接作用，表明DNA異常甲基化是結(jié)腸癌IGFBP7表達(dá)改變的直接調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，我們還采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、遷移實(shí)驗(yàn)和transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)5-aza-dC處理后結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期和凋亡、遷移及侵襲能力的改變。研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理組結(jié)腸癌細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力顯著下降、細(xì)胞周期阻滯、凋

13、亡細(xì)胞數(shù)明顯增加、細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到抑制(P＜0.05)。結(jié)合IGFBP7的表達(dá)變化，我們推測(cè)IGFBP7表達(dá)的恢復(fù)很可能參與了5-aza-dC處理所引起的結(jié)腸癌細(xì)胞上述生物學(xué)行為的改變。 為進(jìn)一步研究IGFBP7基因第一外顯子異常甲基化與該基因表達(dá)的關(guān)系，我們檢測(cè)了46例結(jié)直腸癌組織及配對(duì)的正常粘膜中IGFBP7基因第一外顯子的甲基化情況，并結(jié)合其表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果提示結(jié)直腸癌組織IGFBP7的甲基化率低于配對(duì)的正常組

14、織(P＜0.05)；IGFBP7基因第一外顯子的甲基化情況與其表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)，與體外細(xì)胞系的結(jié)論一致。 綜合上述研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：1.結(jié)直腸癌中，IGFBP7基因的5'端CpG島存在異常甲基化，并且第一外顯子的異常甲基化與該基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。DNA異常甲基化是結(jié)直腸癌IGFBP7基因表達(dá)改變的主要調(diào)控機(jī)制，為IGFBP7在結(jié)直腸癌體內(nèi)、外的差異表達(dá)提供了理論依據(jù)。 2.去甲基化藥物5-a

15、za-dC在誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞IGFBp7基因去甲基化、恢復(fù)基因表達(dá)的同時(shí)，還有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力等方面的作用。IGFBP7表達(dá)的恢復(fù)很可能在上述5-aza-dC處理所引起的結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變中發(fā)揮一定的作用。 3.運(yùn)用亞硫酸氫鈉-測(cè)序法(BSP)結(jié)合聚類(lèi)分析可以有效地尋找與基因表達(dá)相關(guān)的甲基化特異性區(qū)段，結(jié)合甲基化特異性PCR法(MSP)可快速驗(yàn)證該特異區(qū)段DNA