川續(xù)斷總皂苷緩釋微球的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.pdf

1、目的：川續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperWall.ex Henry的干燥根，主含三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類等化合物。因其能“續(xù)筋接骨”而得名，具有補肝腎，行血脈，續(xù)筋骨等功效。臨床上主要用于治療腰膝酸軟，風(fēng)濕痹痛、崩漏、跌打損傷?，F(xiàn)代研究表明續(xù)斷主要的藥理活性有促進成骨細(xì)胞增殖，增加堿性磷酸酶（ALP）表達，增加礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量，促進成骨細(xì)胞鈣素和Ⅰ型前膠原 mRNA的表達，改善骨結(jié)構(gòu)，能顯

2、著增加去卵巢大鼠的骨量；抗炎、抗菌作用；還具有增強機體免疫防御功能等作用。研究表明續(xù)斷皂苷為續(xù)斷藥材主要化學(xué)成分，也是促進骨損傷愈合的活性成分。本論文以其總皂苷提取物為原料藥，選用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為載體材料，制備川續(xù)斷總皂苷 PLGA緩釋微球，對最優(yōu)工藝條件制備的微球進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，并對微球進行體外實驗初步研究，考察其體外釋放機制并觀察川續(xù)斷總皂苷聚乳酸-羥基乙酸共聚物緩釋微球（DATS-PLGA-MC）對小鼠成骨細(xì)

3、胞 MC3T3-E1生長的影響。為川續(xù)斷制劑的后期開發(fā)研究提供科學(xué)的參考。
　　方法：
　　1在一定制備條件下，采用W/O/W型復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備DATS-PLGA-MC，分別于PLGA濃度、制備初乳時水油比、攪拌速度、攪拌時間等不同因素條件下制備微球，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ為對照品，紫外分光光度計測定微球中川續(xù)斷總皂苷的包封率，并利用生物顯微鏡觀察微球大體形態(tài)，粒子檢測儀測定平均粒徑，考察各因素對PLGA微球包封率及形態(tài)、粒徑的影

4、響；再在上述單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇 PLGA的濃度(A)、制備初乳時的水油比(B)、攪拌速度(D)這三個主要影響因素，以微球粒徑和包封率為作為評價指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計正交試驗，確定最佳制備工藝，并進行驗證。
　　2對最優(yōu)工藝制備DATS-PLGA-MC的質(zhì)量評價方法進行研究。采用生物顯微鏡和電子顯微鏡觀察最優(yōu)工藝制備的微球表觀形態(tài)，采用粒子檢測儀測定DATS-PLGA-MC的平均粒徑，并通過圓整度、流動性、堆密度的測定

5、對DATS-PLGA-MC的性質(zhì)表征進行考察。
　　3采用動態(tài)膜透析法測定DATS-PLGA-MC體外釋放度，建立了考察DATS-PLGA-MC體外溶出度的方法，考察了微球在pH1.2、pH6.8、pH7.4三種釋放介質(zhì)中對釋放度的影響，并考察微球在最佳釋放介質(zhì)中的釋放機制。最后將 DATS-PLGA-MC在無菌條件下與成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用MTT法觀察DATS-PLGA-MC對成骨細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1

6、分別于PLGA濃度、水油比、初乳攪拌速度、初乳攪拌時間四種條件下考察其對微球形態(tài)、分散情況及包封率的影響。結(jié)果表明：①隨著PLGA濃度的增加，有利于提高藥物包封率；②隨著水油比值的增大，總皂苷的包封率總體呈現(xiàn)增高的趨勢，水油比由1:5增加到1:10時，包封率明顯增大，當(dāng)水油比值大于1:10時，包封率基本不增反降；③轉(zhuǎn)速從500rpm增加到5000rpm時，藥物包封率從9.35％增加到41.06%，當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加至10000rpm時，包封

7、率反而有所降低；④攪拌時間延長至3min以上時，藥物的包封率差異不大，大約在40%左右，說明乳化時間大于3min時，對微球包封率沒有顯著影響。⑤顯微鏡下對微球形態(tài)及分布顯示當(dāng)PLGA濃度大于6%、水油比值大于1:10、攪拌速度為3000rpm、攪拌時間大于3min時微球形態(tài)較好、分散良好。采用正交優(yōu)化設(shè)計，確定了最佳制備工藝為PLGA濃度為15%，水油比1:10，以5000rpm轉(zhuǎn)速攪拌3min制備初乳，得到平均包封率為45.59%、平

8、均粒徑為5.33μm的DATS-PLGA-MC，該優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。
　　2最優(yōu)工藝制備所得微球外觀呈黃棕色疏松粉末狀，流動性良好，觀察微球形態(tài)，呈球形，表面光滑圓整；粒徑控制在5μm左右，且粒徑分布較為集中。采用紫外分光光度法測得微球中總皂苷的包封率為45.39%，載藥量為5.36%，并采用高效液相色譜法測定DATS-PLGA-MC中川續(xù)斷皂苷Ⅵ和馬錢苷含量，并進行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示該方法合理可行；經(jīng)測定，馬錢苷的包封率為2

9、2.6%，載藥量為0.011%；川續(xù)斷皂苷Ⅵ的包封率和載藥量分別為44.1%、0.529%。
　　3 DATS-PLGA-MC體外溶出實驗中，在pH1.2的釋放介質(zhì)中，微球釋放度非常低，35h后累計釋放度僅為5%左右；pH6.8和pH7.4中相對較快，其中在pH7.4的釋放介質(zhì)中，釋放前35h，釋放較快，為突釋期，35h后累積釋放度達到35%左右，釋放時間持續(xù)到48h后進入持續(xù)釋放期；并且從第2天開始，將Q與t1/2進行Higuc

10、hi方程擬合，得到擬合方程y=13.644x+26.13，r=0.995，說明微球符合Higuchi釋放機制。
　　在考察DATS-PLGA-MC對成骨細(xì)胞增殖的影響實驗中，0.1 mg·mL-1和1 mg·mL-1微球組OD值與正常對照組無顯著性差異（P>0.01），5 mg·mL-1、10 mg·mL-1微球組、陽性對照組與正常對照組的OD值比較，在a=0.01下兩組間均有統(tǒng)計學(xué)意義。表明一定濃度的DATS-PLGA-MC有促