EPO對過度訓練致急性腎損傷的保護作用.pdf

1、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見的臨床疾病，當前中國人口老齡化、具有腎毒性藥物使用以及各種醫(yī)學影像學檢查的開展使其發(fā)病率不斷上升。過度訓練致急性腎損傷（overtraining-induced acute kidney injury，OTIAKI）是AKI的一種，近年受到人們的關(guān)注。OTIAKI是指劇烈的運動或者體能訓練，短時間內(nèi)導致的非創(chuàng)傷性血尿、蛋白尿或者腎功能的異常，其發(fā)病率可占因為訓練而導致

2、的住院患者中的82.9％[1、2]。OTIAKI的臨床表現(xiàn)可為單純性尿檢異常、尿檢異常伴橫紋肌溶解癥或者并發(fā) ARF，嚴重的可引起多器官功能障礙進而導致死亡。所以，了解OTIAKI的發(fā)病機制及腎臟病理變化，對其進行有效的治療，對于OTIAKI病人的腎功能恢復及降低病死率有積極的意義。
　　促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是1906年由Carnot和Deflandre發(fā)現(xiàn)的，至今已有一個多世紀。天然 EPO是一

3、種酸性糖蛋白，相對分子質(zhì)量為34KD，其分泌的主要細胞為肝臟細胞和腎臟皮質(zhì)區(qū)近曲小管周圍的間質(zhì)細胞[3、4]。人類編碼EPO的基因定位于第7號染色體的長臂22區(qū)，含有165個氨基酸[5]。重組的人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）于1989年由Amgen公司研制成功，其相對分子質(zhì)量約為30KD，與天然的EPO具有相同的理化性質(zhì)和生物學活性。無論是 EPO還是 rhEPO都必須與

4、其特異性受體（erythropoietin receptor,EPOR）結(jié)合，才能發(fā)揮有效的生物學效應(yīng)。EPOR是存在于靶細胞表面上的一種跨膜糖蛋白，相對分子質(zhì)量為62KD。人類編碼EPOR的基因定位于第19號染色體短臂24區(qū)，含有507個氨基酸。EPOR包括兩個類型：同型二聚體和異源二聚體。EPO與同型二聚體的 EPOR結(jié)合后，促進紅系祖細胞的增值與分化，發(fā)揮促進造血的作用，臨床上主要用于糾正各種貧血。EPO與異源二聚體的EPOR結(jié)合

5、后，發(fā)揮非促進造血作用[6、7]，如細胞保護作用和免疫調(diào)節(jié)作用等。
　　EPO對器官的保護作用，綜合目前文獻，發(fā)現(xiàn)多數(shù)集中在對腦部缺血缺氧、神經(jīng)以及心臟的保護上，對腎臟的器官保護作用研究較少，其中多數(shù)集中在腎毒性AKI和缺血再灌注性AKI的模型中，幾乎沒有關(guān)于EPO對OTIAKI的研究，因此，探討EPO對過度運動致急性腎損傷的保護作用具有良好的臨床意義，可以促進運動醫(yī)學和臨床醫(yī)學的發(fā)展。本課題采用大鼠無負重單次游泳力竭致AKI動物

6、模型[8]，分別在力竭后不同時間點下腔靜脈采血和取腎臟，采用免疫組織化學染色和病理圖像分析軟件的方法觀察腎臟損傷及Bax、Bcl-2的表達情況，為進一步探明EPO對過度訓練致AKI的保護作用提供參考依據(jù)。
　　研究目的：
　　通過免疫組化染色及病理圖像分析軟件觀察各組腎組織Bax和Bcl-2表達情況，結(jié)合血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和磷酸肌酸激酶（CK）的變化，以及EPO對其上述變化的干預(yù)影響，探討EPO對過度訓練致急

7、性腎損傷的保護作用。
　　材料及方法：
　　主要材料：6-8周齡雄性SPF級wistar大鼠40只，約200-250g，南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供；Anti-Bax antibody（兔抗鼠多克隆抗體），博士德公司提供；Anti-Bcl-2 antibody（兔抗鼠多克隆抗體），博士德公司提供；山羊抗兔二抗，中衫金橋公司提供。
　　1.方法
　　1）分組：實驗大鼠隨機分成3組：安靜對照組（control，CN組

8、，n=5）、力竭運動組（exhaustive swimming，ES組，n=20）、促紅細胞生成素干預(yù)組（erythropoietin，EPO組，n=15）。ES組按大鼠力竭后即刻、6h、12h和24h又分為ESI、ES6h、ES12h和ES24h4個亞組（n=5）；EPO組又分為EPO+ES6h、EPO+ES12h和EPO+ES24h3個亞組（n=5）。
　　2）動物模型建立：采用大鼠無負重單次游泳至力竭法建立過度訓練致急性腎損

9、傷動物模型。大鼠購買后，SPF級動物實驗室中安靜飼養(yǎng)7天預(yù)適應(yīng)。參照文獻[8]方法，自制玻璃鋼游泳池（150×60×80cm3），水深約70cm，超過大鼠身長的2倍，水溫保持在30±2℃。各實驗組大鼠于實驗前一天上下午各適應(yīng)性游泳30分鐘，剔除不會游泳的大鼠，實驗當天再次放于水中，游泳直至力竭。CN組和ES組分別于游泳前30分鐘腹腔內(nèi)注射生理鹽水（0.3ml/kg）作為空白對照。EPO組則注射益比奧（3000 IU/kg）。力竭標準[8

10、]：（1）游泳動作明顯不協(xié)調(diào)；（2）沉入水底超過10s；（3）撈出后沒有逃避反應(yīng)，且放在平面無法完成翻正反射。其中（1）為必須條件。
　　3）數(shù)據(jù)收集:CN組、ES組和EPO干預(yù)組分別于相應(yīng)的時間點腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/kg）麻醉，腹部消毒后沿腹正中線切開，下腔靜脈取血后處死，留取左腎組織做石蠟切片。全血3000轉(zhuǎn)/分高速離心10分鐘后留取血清，保存于-20℃冰箱，留測血清肌酐、尿素氮、磷酸肌酸激酶。左腎組織置于10

11、%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋以做常規(guī)HE染色觀察腎組織病理變化，免疫組織化學染色觀察Bax和Bcl-2的表達及分布。采用Olympus BX41光學顯微鏡觀察，Olympus BX40F4顯微數(shù)碼照相機采圖，每張切片取5個高倍鏡視野，每個視野>500個細胞，分別計算平均光密度值（Average optical density，AOD），平均光密度值=積分光密度值/所選定對象的面積，取平均值，比較各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2的表

12、達差異。
　　4）統(tǒng)計方法：用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析，所有數(shù)值用均數(shù)±標準差（X±S）表示，多組間均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、CN組大鼠精神狀態(tài)好，反應(yīng)敏銳，自由活動，正常飲食飲水。ES組大鼠運動后頭部不能抬起，四肢癱軟無力，無法站立，精神差，對聲光等刺激反應(yīng)遲鈍，約四十多分鐘后才可站立并行走，開始飲水、少量進食。E

13、PO干預(yù)組大鼠運動后一般情況處于CN組與ES組之間。
　　2、ES組大鼠力竭運動后即刻血清Cr、BUN及CK值均增高，ES6h后達高峰，之后數(shù)值逐漸下降，至ES24h約降到正常水平。EPO干預(yù)各組的血清Cr、BUN及CK值均較同期ES組改善。
　　3、光鏡：CN組腎組織無明顯改變；ES組及EPO干預(yù)組發(fā)生急性腎損傷，有腎小球缺血及腎小管缺血缺氧的表現(xiàn)，可見腎小球體積縮小、腎小球囊擴張、毛細血管袢被擠壓至血管極測；近端腎小管上

14、皮細胞部分水腫，可有空泡樣變性；腎間質(zhì)水腫、間質(zhì)內(nèi)有紅細胞及炎癥細胞浸潤，腎小管損傷積分升高。隨著力竭后時間的延長，上述表現(xiàn)更加多且更加嚴重，并可見到腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)區(qū)大量細胞的細胞核深染，有固縮現(xiàn)象、部分腎小管腔內(nèi)還可見透明管型、蛋白管型及顆粒管型等，腎小管損傷積分呈上升趨勢。EPO干預(yù)組與同期力竭運動組相比，腎小球及腎小管損傷程度均變輕，腎小管損傷評分變小。
　　4、大鼠無負重單次游泳至力竭后，腎組

15、織Bax免疫組化染色示：CN組Bax弱表達，ES組腎組織細胞胞漿中Bax蛋白的表達隨時間的延長逐漸增強，EPO干預(yù)各組Bax的表達與CN組相比較，表達增強，與同期力竭組相比較，表達減弱。
　　5、腎組織Bcl-2免疫組化染色結(jié)果示：CN組有一定的Bcl-2表達，力竭運動后，ES組Bcl-2蛋白的表達呈先減弱后增強的趨勢，EPO干預(yù)組與同期力竭組相比較，Bcl-2蛋白表達均增強。
　　結(jié)論：
　　1、無負重單次游泳至力竭