抗豬瘟重組活載體疫苗及DNA疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析.pdf

1、本文論述了抗豬瘟重組活載體疫苗及DNA疫苗的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析。 1、抗豬瘟DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力研究。據(jù)報(bào)道，牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)的VP22蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。本試驗(yàn)首先應(yīng)用PCR擴(kuò)增了CSF病毒(CSFV)E2基因和BHV-1VP22基因。將E2基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+，獲得重組質(zhì)粒pcDE2，再將VP22基因連接到E2基因的下游，獲得重組質(zhì)粒pcDEV。將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞

2、，通過WesternBlot分析證明E2基因獲得表達(dá)；間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)含VP22基因的重組質(zhì)粒表達(dá)的E2蛋白在細(xì)胞內(nèi)呈彌漫性分布，表明VP22具有胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。進(jìn)一步以鼠及兔為動物模型評價(jià)以上兩種重組質(zhì)粒的免疫效力。首先將21只BALB/c小鼠分三組(每組7只)，分別肌肉注射pcDNA3.1+、pcDE2、pcDEV，共免疫3次，每次間隔2周(每次每只鼠注射100μgDNA)。分別于首免后2周、4周、6周采血，用IDEXX豬瘟病

3、毒抗體檢測試劑盒檢測抗體。結(jié)果顯示，通過3次免疫后，pcDE2和pcDEV免疫組均產(chǎn)生了針對E2蛋白的抗體，pcDEV產(chǎn)生的抗體滴度最高，表明VP22促進(jìn)了E2蛋白的表達(dá)或提呈。將9只白兔隨機(jī)分成3組(每組3只)，分別注射pcDNA3.1+、pcDE2、pcDEV，免疫三次，每次間隔兩周，兩后腿脛前肌肌肉注射，每只每次500μg。分別于首免后2周、4周、6周耳靜脈采血，分離血清，監(jiān)測抗體變化，結(jié)果顯示二免后，兩個(gè)重組質(zhì)粒免疫組即發(fā)生了血

4、清抗體陽轉(zhuǎn)，其中pcDEV免疫組陽轉(zhuǎn)率和抗體水平均高于pcDE2組。首免后7周，對所有家兔靜脈注射1：40的484代豬瘟兔化病毒(淋巴脾臟毒)(1mL/只)，攻毒之前三天每隔12h測溫一次，攻毒24h后，每隔6h測體溫一次，連續(xù)測96h。結(jié)果顯示空質(zhì)粒pcDNA3.1+免疫組3只兔在攻毒后24-48h左右開始發(fā)熱，持續(xù)約36h，并呈定型熱反應(yīng)；pcDEV免疫組3只兔在攻毒后體溫、食欲、精神狀態(tài)均正常；pcDE2免疫組1只兔各項(xiàng)指標(biāo)均正常

5、，另外2只于48h有過性發(fā)熱反應(yīng)，持續(xù)約12h，體溫高出正常0.5℃。本試驗(yàn)結(jié)果表明BHV-1的VP22基因與CSFV的E2基因融合表達(dá)可促進(jìn)E2蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫效果。 2、表達(dá)多個(gè)外源基因的重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析。表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重組偽狂犬病毒(PRV)已在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建成功，動物試驗(yàn)證明此重組病毒疫苗免疫豬可有效抵抗PRRSV和PRV的攻擊。本試驗(yàn)在此成功的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將CS

6、FV的E2基因插入到重組PRV中，期望獲得可以表達(dá)PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重組PRV。首先構(gòu)建了含PRVTK基因片段的重組質(zhì)粒，再將SV40啟動子控制下的LacZ基因表達(dá)盒與分別在CMV啟動子控制下的含有CSFVE2基因表達(dá)盒和PRRSVGP5基因表達(dá)盒插入到TK基因中形成轉(zhuǎn)移載體，通過同源重組將轉(zhuǎn)移載體中的目的基因插入到PRVBartha-K61株TK基因中，通過藍(lán)斑篩選重組病毒，并對所獲得的一株重組病毒進(jìn)行了純化和鑒

7、定，命名為rPRV-E2-GP5。經(jīng)Westernblot、間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)E2和GP5基因在重組病毒感染細(xì)胞中均獲得了表達(dá)，其抗原性與親本病毒相似。通過Vero、IBRS2、PK-15、CEF細(xì)胞對該重組病毒與親本病毒的增殖滴度和致細(xì)胞病變進(jìn)行比較，未見顯著差異，表明在PRVTK基因中至少可以插入9.4kb的基因片段并同時(shí)表達(dá)3個(gè)外源蛋白而不影響其生物學(xué)特性。 本研究構(gòu)建的新型抗豬瘟DNA疫苗及其表達(dá)多個(gè)外源基因的重組偽狂