WU多瘤病毒的篩查、基因克隆和蛋白的表達(dá).pdf

1、WU多瘤病毒(WU polyomavirus,WUPyV)是新近從呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒,目前其臨床意義上不明確。為了解WUPyV在深圳和汕頭地區(qū)的感染情況,以及WUPyV的分子生物學(xué)特征,為該病毒的致病性、診斷等研究提供科學(xué)依據(jù)。本論文建立了WUVyV的篩查技術(shù),對(duì)WUPyV基因進(jìn)行了克隆及核酸序列測(cè)定,在此基礎(chǔ)上原核表達(dá)了結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白STAg(Small TumorAntigen),并進(jìn)行了初步抗

2、原性分析。
　　 收集2006年6月-2009年6月在深圳和汕頭地區(qū)采集的1509份呼吸道急性感染住院兒童咽拭子分泌物。經(jīng)核酸檢測(cè),其中17例(17/1.509,1.1％)為WUPyV核酸陽(yáng)性,均為4歲以下患兒,男女比例11:6。17例WUPyV陽(yáng)性病人的主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、喘息等典型的呼吸道感染癥狀。臨床診斷為支氣管肺炎(10例)、喘肺(3例)、毛細(xì)支氣管炎(2例),上呼吸道感染(1例),皰疹性咽峽炎(1例)。所有W

3、UPyV陽(yáng)性病例中與其他病毒合并感染的有7例,其中RSV(4例),IVA(1例),RHV(1例),ADV(1例),共同感染率為41%。
　　 根據(jù)參考文獻(xiàn)及GenBank中已知的全基因序列設(shè)計(jì)5對(duì)引物,以WUPyV陽(yáng)性病例的總核酸為模板,PCR分段擴(kuò)增出WUPyV的C1、C2、C3、C4和C55個(gè)片段,將它們分別連入具有氨芐青霉素抗性基因的pBM-T Easy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10,經(jīng)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng),提取質(zhì)粒,PCR鑒定之

4、后,測(cè)序,通過(guò)GenBank及Blast比對(duì),拼接,獲得WUPyV的全基因序列,并提交至GenBank(accession numbers:GQ926975-GQ926980)。將獲得的6株WUPyV全基因序列(基因全長(zhǎng)3例為5228nt,3例為5229nt)與NCBI已經(jīng)公布的國(guó)內(nèi)外全基因序列進(jìn)行核酸序列比較分析發(fā)現(xiàn),毒株之間基因同源性均在98%以上,為高度保守病毒,基因突變?cè)?%-1.5%,突變位點(diǎn)主要發(fā)生在非編碼區(qū)和VP1編碼區(qū),

5、而VP2和STAg編碼區(qū)的突變相對(duì)較少。
　　 根據(jù)WUPyV全基因序列的測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)引物,以WUPyV陽(yáng)性病例的總核酸為模板,擴(kuò)增出VP1、VP2、VP3及STAg的全基因片段,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xbal消化后,連入融合表達(dá)載體PGEX-20T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)了氨基端融合GST的目的蛋白。Labworks蛋白分析軟件分析結(jié)果表明,表達(dá)產(chǎn)物的分子量分別為69520、63090、5