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1、重組人紅細(xì)胞生成素(1lecombinant Human Erythropoietin,rHLIEPO)是一種高度糖基化的糖蛋白,其分子骨架為165個(gè)氨基酸組成的肽鏈,具3個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn),其中糖基部分的重量約占40%。它在生物體內(nèi)的活性不僅與其氨基酸序列有關(guān),而且和蛋白質(zhì)糖基化程度密切相關(guān)。影響rHuEPO生物學(xué)活性的主要部分是糖基上的唾液酸,唾液酸的含量不同使rHuEPO的活性不同,故HuEPO糖基化
2、程度的測(cè)定是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)過程中,存在工程細(xì)胞株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝的差異,會(huì)導(dǎo)致rHuEPO蛋白的糖基化的不同,從而影響rHuEPO產(chǎn)品的質(zhì)量。目前rHuEPO的產(chǎn)品質(zhì)量控制主要根據(jù)體內(nèi)效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果,然而目前的rHuEPO體內(nèi)檢驗(yàn)方法有明顯的缺陷,周期較長(zhǎng),并且存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不太理想。 為此,利用檢測(cè)rHuEPO糖基化程度的幾種理化方法,對(duì)六批不同生產(chǎn)工藝的rHuEPO原液,分別采用Folin
3、-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量、利用間苯二酚顯色法測(cè)定總唾液酸含量、利用等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)、利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測(cè)連接的多種寡糖形式以及定,性和定量分析各異構(gòu)體的豐度、利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)免疫學(xué)活性、利用動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定生物學(xué)活性。根據(jù)各檢測(cè)結(jié)果,利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析其與生物學(xué)活性的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液酸含量和生物學(xué)活性之間存在明顯的正相關(guān),而免疫學(xué)活性與生物學(xué)活性之間有明顯的偏離,兩者不存在相
4、關(guān)性;等電點(diǎn)與生物活性存在一定相關(guān)性,利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢出rHuEPO蛋白均有糖基化不同的八個(gè)異構(gòu)體,研究發(fā)現(xiàn)各異構(gòu)體的豐度不僅僅與生物學(xué)活性和唾液酸之比存在顯著的相關(guān)性,而且與免疫學(xué)活性和唾液酸之比存在顯著的相關(guān)性,在此基礎(chǔ)上又研究了兩者之間的回歸關(guān)系,建立主要影響因子與免疫學(xué)活性、生物學(xué)活性和唾液酸之比線性回歸函數(shù)模型。,從而直觀、準(zhǔn)確的判斷rHuEPO的產(chǎn)品質(zhì)量,為全面快速評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù),為生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和提高提供指導(dǎo)依據(jù)
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