洛伐他汀合成調(diào)控基因LovE-mkH的克隆與表達(dá).pdf

1、研究目的： 克隆紅曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶調(diào)控基因lovE和mkH并進(jìn)行比對(duì)分析；原核表達(dá)并純化洛伐他汀合成轉(zhuǎn)錄因子lovE蛋白；構(gòu)建lovE基因的真核表達(dá)載體。 研究方法： 根據(jù)genebank已知的土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設(shè)計(jì)引物，以土曲霉和紅曲霉基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T-simple載體。利用DNAMAN等軟件以及互聯(lián)網(wǎng)資源對(duì)lovE和mkH測(cè)序結(jié)果

2、與其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)。根據(jù)genebank已知的土曲霉洛伐他汀合成酶基因序列另行設(shè)計(jì)引物，以土曲霉基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增lovE基因并定向克隆到pET-21b原核表達(dá)載體。IPTG誘導(dǎo)lovE-His融合蛋白表達(dá)，應(yīng)用Ni-NTA His標(biāo)簽蛋白純化樹(shù)脂親和層析純化融合蛋白。根據(jù)genebank已知的土曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以土曲霉基因組DNA為模板PCR分別擴(kuò)增lovE和lovElong基因并以兩對(duì)

3、插入位點(diǎn)定向克隆到pBC–hygro真核表達(dá)載體。 研究結(jié)果： 分別擴(kuò)增得到1512bp和1464bp的目的片段lovE和mkH；成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET–lovE，表達(dá)出約58KDa的融合蛋白lovE-His并純化至電泳純；成功構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pBC-lovE和pBC-lovElong。 研究結(jié)論： lovE和mkH同源性很高，并與genebank中相關(guān)已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶調(diào)