弓形蟲P30單基因疫苗與P30-ROP2復(fù)合基因疫苗免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進(jìn)展。但是，弓形蟲滅活疫苗免疫保護(hù)力低；減毒活疫苗易恢復(fù)毒力，不能用于人體；亞單位疫苗生產(chǎn)過程復(fù)雜，且抗原蛋白不能形成正確的天然構(gòu)象因此免疫活性不足，使得弓形蟲核酸疫苗成為一個(gè)新的研究方向。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明，弓形蟲階段特異性抗原分子只能激發(fā)機(jī)體的階段特異性保護(hù)免疫[2,3]。因此，使用來自不同階段的多抗原基因的復(fù)合

2、基因疫苗可能刺激機(jī)體產(chǎn)生較全面的免疫保護(hù)性。 P30(SAG1)作為弓形蟲速殖子期特異的主要表面抗原之一，具有高度的免疫原性和免疫保護(hù)性，是弓形蟲感染免疫診斷和疫苗開發(fā)的的主要候選抗原。ROP2(Rhoptry2)蛋白是弓形蟲棒狀體分泌的一種蛋白，主要協(xié)助蟲體入侵宿主細(xì)胞，在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期和子孢子期中均有表達(dá)，具有高度的保守性和免疫原性，能充分刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，其作為疫苗候選分子具有巨大的

3、潛力。 本研究應(yīng)用基因工程方法構(gòu)建弓形蟲單基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-P30；并將之與pcDNA3.1-P30-ROP2復(fù)合基因真核表達(dá)質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系(Hela)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用Trizol提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一條鏈；對管家基因β-actin進(jìn)行PCR驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄；然后分別對P30、P30-ROP2基因片段進(jìn)行PCR，證實(shí)真核表達(dá)載體pcDNA3.1能夠攜

4、帶弓形蟲抗原基因P30及P30-ROP2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此后，用堿裂解法大量制備質(zhì)粒pcDNA3.1-P30及pcDNA3.1-P30-ROP2，以肌注方式接種BalB/c小鼠(100μg/只)，分別于2周、4周后加強(qiáng)免疫一次，并設(shè)立PBS組、pcDNA3.1空載體組為對照，觀察分析核酸疫苗所誘導(dǎo)的小鼠的免疫效應(yīng)以及抵抗致死劑量弓形蟲感染的能力。分別于第14天(二次免疫前)、第28天(三次免疫前)、第42天(三次免疫后兩周)、

5、第56天(三次免疫后四周)用眼眶后靜脈叢采血法收集小鼠血清。并于第56天，每組處死8只動(dòng)物，制備脾細(xì)胞懸液用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；每組其余動(dòng)物用做攻擊感染實(shí)驗(yàn)。ELISA法測定小鼠血清IgG抗體；MTT法測定小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活性以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；用羊抗鼠細(xì)胞因子試劑盒測定小鼠血清IFN-γ、IL-4；流式細(xì)胞技術(shù)測定淋巴細(xì)胞亞群；弓形蟲RH株攻擊感染。結(jié)果：兩實(shí)驗(yàn)組(pcDNA3.1-P30組及pcDNA3.1-P30-ROP2組)小鼠

6、抗體滴度均于三次免疫后四周達(dá)到最高值，且與對照組間差別具有顯著性意義(P＜0.01)；pcDNA3.1-P30及pcDNA3.1-P30-ROP2組的NK細(xì)胞殺傷率分別為41.34±0.89、41.36±0.95，pcDNA3.1及空白對照組分別為40.32±1.16、40.36±2.09。兩實(shí)驗(yàn)組與對照組間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；兩實(shí)驗(yàn)組淋巴紐胞轉(zhuǎn)化率較對照組均有提高，其中僅復(fù)合基因組與對照組間差別具有顯著性意義(P＜0.