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文檔簡介
1、研究背景與目的:
惡性腫瘤嚴重威脅人類健康。結(jié)直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤。在我國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升,目前居于第4位。在我國大城市中,結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)以每年4%的增長速度上升。由于人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變,平均壽命的提高,結(jié)直腸癌的發(fā)病率還有進一步上升的可能。結(jié)直腸癌在全世界每年新發(fā)病120萬例,確診后,患者的5年存活率僅55%。
造成這種現(xiàn)狀的原因主要有3個:1、結(jié)直腸癌的病因不明確,因
2、此無法做到有效的一級預防;2、缺乏便捷、高效的診斷方法,這種情況使腫瘤的二級預防成為空談;3、治療手段雖多,但總體療效不理想,且治療過程中的副作用給患者帶來的痛苦遠大于其益處。因此,對結(jié)直腸的研究,無論是病因還是篩查、早期診斷,或是治療方式方法,都有可能使現(xiàn)患病者和高危人群以及其他潛在患者受益。
目前結(jié)直腸癌常用的診斷方法有:1、內(nèi)鏡檢查,如纖維結(jié)腸鏡、電子結(jié)腸鏡;2、血清學檢查,多種腫瘤標志物的檢測;3、影像學檢查,如C
3、T、MRI、胃腸道鋇餐造影、TRUS(經(jīng)直腸超聲檢查)等;4、其他檢查,如基因?qū)W檢查。以上各種方法均不同程度地存在病人依從性差、特異度和檢測靈敏度不高等問題。在治療方面,除了對已有治療手段的不斷改進,新藥的開發(fā),尤其是靶向藥物的開發(fā)也取得了豐碩的成果。此外,對結(jié)直腸癌治療的認識也發(fā)生了轉(zhuǎn)變,個體化治療為越來越多的人接受并得到前所未有的重視,它的基礎(chǔ)是明確的靶點和有效的療效預測蛋白。
隨著蛋白質(zhì)組學,尤其是疾病蛋白質(zhì)組學的不
4、斷發(fā)展,大量的疾病差異蛋白被發(fā)現(xiàn),經(jīng)過后續(xù)研究,從中遴選出疾病的診斷、分子治療及其預后判斷的分子生物學標志物。蛋白質(zhì)組學的進步離不開蛋白質(zhì)組學技術(shù)的迅猛發(fā)展。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)功能強大,能同時對多個樣品進行相對和絕對定量研究。多維液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)合iTRAQ技術(shù)能得到完整的疾病蛋白質(zhì)
5、組,并能定量其中的蛋白。本研究旨在應用這種蛋白質(zhì)組學技術(shù),通過對正常結(jié)直腸粘膜及結(jié)直腸癌腫瘤組織進行分析,鑒定并驗證得到對結(jié)直腸癌有診斷或治療意義的分子標志物。
方法:
1、研究對象
5例結(jié)直腸癌患者的正常結(jié)直腸粘膜及結(jié)直腸腫瘤組織。
2、組織標本的收集
(1)新鮮組織標本的收集:在手術(shù)中,標本離體后30分鐘內(nèi)收集新鮮組織標本,深低溫保存;
(2)石蠟組
6、織標本的收集:組織標本經(jīng)福爾馬林固定后制成蠟塊以備檢測。
3、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定結(jié)直腸癌腫瘤組織與正常結(jié)直腸粘膜差異蛋白
分別將5例正常粘膜樣本蛋白及5例腫瘤組織樣本蛋白混合,經(jīng)胰酶消化以后,用iTRAQ定量試劑盒分別標記上述兩種組織蛋白。首先用強陽離子交換對上述蛋白混合物進行第一維分離,根據(jù)峰型和時間共收取20個梯度;然后采用反相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對上述樣品進行第二維分離,據(jù)此采集多肽質(zhì)譜圖并對蛋
7、白質(zhì)進行定量;經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索,描繪出結(jié)直腸癌組織差異蛋白質(zhì)譜。結(jié)合生物信息學數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白質(zhì)亞細胞定位和功能并篩選出目的蛋白。
4、免疫組化檢測目的蛋白在組織中的亞細胞定位
以免疫組織化學法檢測其表達水平。收集58例結(jié)直腸癌腫瘤組織和遠端正常粘膜組織,經(jīng)福爾馬林固定后,行石蠟包埋,然后切片。組織切片經(jīng)脫蠟至水、高壓修復抗原、雙氧水封閉內(nèi)源性酶后,順序孵育一抗、二抗;然后用DAB顯色、再經(jīng)過蘇木素復染。采用雙
8、盲法由兩位病理學醫(yī)師對實驗結(jié)果進行判斷。診斷標準:在5個視野觀察200個上皮細胞,觀察染色強度和陽性細胞數(shù)后進行打分,兩者相加之和即為評分。根據(jù)陽性細胞的百分比打分的標準:0分——陰性;1分——陽性細胞數(shù)<10%;2分——11%≤陽性細胞數(shù)<50%;3分——51%≤陽性細胞數(shù)<80%;4分——陽性細胞數(shù)≥80%。根據(jù)染色強度進行打分的標準:0分——無;1分——弱陽性;2分——中等陽性;3分——強陽性。
5、Western-
9、blotting實驗
用Western-blotting實驗驗證目標差異蛋白的表達。取適量樣本蛋白行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)膜,順序孵育一抗、二抗。然后用電化學發(fā)光法顯示條帶。所得條帶用PD QUEST軟件進行半定量分析。
4、q RT-PCR檢測目的基因的表達
通過q RT-PCR檢測EHD2、PDLIM7的基因在結(jié)直腸癌腫瘤組織及正常粘膜組織中的表達。
結(jié)果:
1
10、、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定組織差異蛋白質(zhì)
共鑒定到802個蛋白。認定差異蛋白質(zhì)的標準-1、含量差異P<0.05,2、在正常組織與腫瘤組織中的含量比值≥1.5或≤0.5。同時滿足以上2項的即為差異蛋白。共有68個差異蛋白(33個上調(diào),35個下調(diào))。經(jīng)Swiss-Prot和GeneOntcology數(shù)據(jù)庫搜索,差異蛋白定位于細胞核、細胞漿、細胞膜和細胞外基質(zhì),其功能與細胞粘附、細胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導、結(jié)合等相關(guān)。從中挑選了EH
11、D2及PDLIM7進行驗證。
2、免疫組織化學結(jié)果
EHD2表達于84.48%的正常粘膜組織,在結(jié)直腸癌腫瘤組織中低表達,僅表達25.86%。
PDLIM7表達于81.03%的正常粘膜組織,在結(jié)直腸癌腫瘤組織中低表達,僅表達29.31%。
3、Western-blotting和qRT-PCR實驗
證實了EHD2及PDLIM7在結(jié)直腸癌組織中表達低于正常粘膜組織。
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