日本血吸蟲蟲卵及相關(guān)抗原的研究.pdf

1、血吸蟲病是人畜共患寄生蟲病。血吸蟲感染的實驗診斷在血吸蟲病防治中發(fā)揮重要作用，目前血吸蟲蟲卵依然是主要的血吸蟲病診斷抗原，對血吸蟲蟲卵的提取、蟲卵可溶性抗原(SEA)的認(rèn)識依然不足。
　　本課題目的是建立一種快速提取純凈蟲卵的方法;檢測用該法提取蟲卵制備SEA作為血吸蟲病檢測抗原的可行性;然后采用免疫親和層析的方法收集與血吸蟲病IgG發(fā)生特異性結(jié)合的SEA組分并進(jìn)行鑒定和分析;最后從鑒定的抗原組分中選取一種抗原進(jìn)行基因的克隆表達(dá)，

2、檢測其作為診斷抗原的價值。
　　用不同濃度的NaOH、在不同溫度、用不同時間消化含有蟲卵的肝臟勻漿液，以確定蟲卵提取最佳條件;用方陣實驗確定以此法提取的SEA最佳抗原包被濃度并采用ELISA法檢測現(xiàn)場獲得的75份血吸蟲陽性、60份血吸蟲陰性水牛血清，以評價抗原的檢測效果;最終用該SEA組分試制了日本血吸蟲血清檢測的間接血凝試劑。結(jié)果表明NaOH消蝕法提取組織中蟲卵的最佳條件為:NaOH濃度為5％～10％，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時間

3、為5-10min;該法制備的蟲卵純凈度高，得率為常規(guī)法的3倍以上;NaOH消蝕法提取抗原的檢測靈敏度比過篩提取蟲卵所得抗原顯著性提高(p＜0.05);用消蝕法提取蟲卵抗原檢測水牛血清其靈敏性為93％，過篩法為88％，特異性為100％，過篩法為97％(P＞0.05)。所試制的間接血凝試劑對于檢測兔、鼠血清具有較好的效果。
　　為進(jìn)一步從SEA獲得具有診斷價值的主要抗原信息，從血吸蟲病陽性鼠血清純化得到IgG，并將其固化到樹脂上;通過

4、免疫親和層析的方法收集與IgG發(fā)生特異性結(jié)合的SEA抗原組分并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、糖蛋白和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:陽性BALB/c鼠血清中純化的IgG通過免疫親和層析收集SEA的組分保持了抗原性;質(zhì)譜共鑒定到76個蛋白群的262個蛋白質(zhì);主要參與血吸蟲的代謝過程、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等;這些蛋白具有結(jié)合及催化活性、電子載體活性、酶調(diào)節(jié)活性等相關(guān)功能;Dot-blot/SDS-PAGE結(jié)合糖蛋白染色顯示，SEA層析組分具有糖鏈成分且為各種糖蛋白

5、的組合，分子量分布范圍從37-170kd; N-端糖基化預(yù)測顯示抗原組分中有57個蛋白群中的蛋白具有N-端糖基化位點(diǎn);這些可能的糖蛋白主要參與信號傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)過程、應(yīng)激反應(yīng)、移動等生物過程。
　　根據(jù)蟲卵可溶性抗原鑒定信息，選取SjP40蛋白作為研究對象;利用PCR獲得了基因的全長表達(dá)片段，構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40并獲得了重組表達(dá)蛋白，rSjP40主要以可溶性蛋白的形式存在;Western bl