GFP-NSCs早期移植治療腦出血大鼠的最佳時間窗的研究.pdf

1、目的:
　　干細胞作為可能治療出血性腦卒中的方法之一，早期動物實驗證實神經(jīng)干細胞移植可產生腦保護性作用，促進神經(jīng)功能恢復，參與免疫調節(jié)，但其移植治療的最佳時間窗尚不清楚，還存在較大爭議。因此，本研究探討神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)早期原位移植入腦出血大鼠模型的最佳時間點。
　　方法:
　　(1)模型制作:選擇年輕雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(280-320g)作為模型動物，

2、利用腦立體定向儀向大鼠尾狀核注射Ⅳ型膠原酶建立腦出血模型。主要從以下三個方面來評價模型的穩(wěn)定性:腦組織解剖標本冠狀面切片、MRI檢查、神經(jīng)功能行為學。解剖標本和MRI檢查評價血腫的位置、大小和形態(tài)，神經(jīng)功能行為學評價大鼠神經(jīng)功能缺損的程度。
　　(2)NSCs培養(yǎng):鼠胚胎源性神經(jīng)干細胞原代購于廣州賽業(yè)公司，培養(yǎng)傳代，利用相差顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞的生長和分化形態(tài)，并行nestin免疫熒光染色鑒定神經(jīng)干細胞，用map2標記神經(jīng)元及GF

3、AP標記星形膠質細胞來鑒定神經(jīng)干細胞的分化能力。
　　(3)實驗分組:A組單純腦出血組空白對照組(ICH+PBS)， B組神經(jīng)干細胞移植對照組(SHAM組SHAM)，C組神經(jīng)干細胞移植組(ICH+GFP-NSCs):分別在腦出血后3小時、1天、3天、5天、7天移植神經(jīng)干細胞。
　　(4)行為學:觀察神經(jīng)干細胞移植對腦出血大鼠的神經(jīng)功能恢復的影響。
　　(5)免疫熒光:應用免疫熒光技術觀察神經(jīng)干細胞在腦出血大鼠腦內NSC

4、移植前后的存活情況。
　　(6)ELASA:應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELASA)檢測腦出血和神經(jīng)干細胞移植后大鼠腦組織中相關細胞因子(bFGF、EGF、VEGF)的變化。
　　結果:
　　(1)Ⅳ膠原酶建立的腦出血模型腦內血腫形態(tài)規(guī)則，血腫大小穩(wěn)定，邊界清楚，對側肢體功能障礙明顯。
　　(2)神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中，增殖形成大量的神經(jīng)球，nestin染色陽性證實為神經(jīng)干細胞，經(jīng)誘導分化后MAP-2和GFAP染色陽性，

5、表明神經(jīng)干細胞可進一步分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞。
　　(3)神經(jīng)干細胞移植治療腦出血大鼠后，可以促進大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復，以3天移植改善最為顯著。
　　(4)神經(jīng)干細胞原位移植治療腦出血大鼠，14天時，在顱內可以檢測到存活的GFP-NSCs，其中3天移植組和5天移植組中，GFP-NSCs在形態(tài)上、數(shù)量上明顯占優(yōu)勢。
　　(5)GFP-NSCs原位移植增加了腦組織中大鼠堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、大鼠表皮生長

6、因子(EGF)、大鼠血管內皮生長因子(VEGF)的表達，其中3天移植治療組中， bFGF、EGF的表達顯著多于其他移植治療組，VEGF的表達在各治療組中無明顯差異。
　　(6)GFP-NSCs原位移植增加了腦組織中大鼠神經(jīng)生長因子(NGF)、大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、大鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、大鼠膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達，其中3天移植組中，上述四個神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達水平顯著高于其他4個移植治