1α,25-二羥維生素D3對BMP2基因表達的調控及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 維生素D3是目前臨床上治療骨質疏松的常用藥物，它在體內通過羥化生成活性代謝產物1，25(OH)2D3（1α，25-dihydroxyvitaminD3）而發(fā)揮生理作用。1，25(OH)2D3是一種具有多種生物效應的激素前體，其主要是通過與靶細胞內的維生素D受體(VitaminDreceptor，VDR)結合后調節(jié)各種基因的表達，從而發(fā)揮其生理效應。它具有促進腸道鈣和磷的吸收，促進腎小管對鈣、磷的重吸收的作用。它

2、一方面可以協(xié)同甲狀旁腺激素刺激骨組織脫鈣，提高血鈣、磷濃度;另一方面也可以抑制甲狀旁腺激素的合成釋放，從而抑制甲狀旁腺激素的骨溶解作用，使骨丟失減少。但是目前關于1，25(OH)2D3對骨形成及成骨細胞作用的報道仍很不一致。部分研究認為1，25(OH)2D3可誘導成骨細胞的分化成熟，對骨組織的形成有直接的促進作用。而另外一些研究則認為1，25(OH)2D3對成骨細胞有明顯的抑制作用，直接抑制骨形成。因此，1，25(OH)2D3對骨形成的

3、作用及機制仍需要進一步的研究。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP）是一組分泌性的多功能蛋白質，除BMP1外均屬于TGF-β（轉化生長因子-β）超家族成員，在體內可以通過旁分泌和自分泌的形式誘導骨的形成，是目前公認最強的骨誘導因子。BMP2是其中研究和應用最廣泛的成骨生長因子之一，它可以在體外誘導間充質干細胞向成骨細胞分化，體內誘導骨形成。BMP2在啟動和調節(jié)骨形成中起著關鍵的作用，因

4、此任何影響B(tài)MP2基因表達的因素都可能會影響骨形成。
　　 若能闡明1，25(OH)2D3與BMP2基因表達的關系，對進一步理解1，25(OH)2D3在骨形成中的作用會有很大的幫助，目前文獻中尚未有此類報道。
　　 遺傳性高鈣尿(Genetichypercalciuricstone-forming，GHS)大鼠是研究特發(fā)性高鈣尿(Idiopathichypercalciuria，IH)患者的理想動物模型，它們都表現(xiàn)為小腸

5、的鈣吸收增加，腎臟的尿鈣重吸收減少，骨密度減低。既往的研究表明GHS大鼠中腸鈣吸收的增加，尿鈣重吸收的減少與組織中VDR水平的增加有很大的關系。但是GHS大鼠中骨密度減低的原因仍不是十分清楚。本研究旨在通過探尋GHS大鼠中VDR與BMP2的關系來分析這種動物模型中骨密度減低的可能原因，并進一步探討1，25(OH)2D3對BMP2基因表達的調控及可能的機制，從而進一步分析1，25(OH)2D3在骨形成中的作用及機制。
　　 目的:

6、
　　 1、研究GHS大鼠和正常SD大鼠相同組織中維生素D受體蛋白和BMP2mRNA的基礎表達水平并進行比較，分析VDR和BMP2可能存在的聯(lián)系。
　　 2、體外培養(yǎng)GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質干細胞，以及UMR-106細胞，研究1，25(OH)2D3對BMP2mRNA表達的影響。
　　 3、研究1，25(OH)2D3調控BMP2基因轉錄表達的作用機制。
　　 4、探討DNA甲基化和組蛋白修飾在1，25

7、(OH)2D3調控BMP2基因表達中的作用。
　　 方法:
　　 1、選取成年GHS大鼠和SD大鼠，斷頸處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，抽取骨髓，應用紅細胞裂解法及直接貼壁法獲取并體外培養(yǎng)骨髓基質干細胞，無菌條件下取出腎臟及小腸，置入液氮中快速冷凍。應用蛋白質印跡(Westernblot)法檢測GHS和SD大鼠骨髓基質干細胞、腎臟和小腸中的維生素D受體蛋白的水平。應用實時定量聚合酶鏈反應(Quantitativereal

8、-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)法檢測GHS和SD大鼠骨髓基質干細胞、腎臟和小腸中的BMP2mRNA的表達。
　　 2、分別應用1，25(OH)2D3處理體外培養(yǎng)的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質干細胞和UMR-106細胞，應用qRT-PCR法檢測細胞中BMP2mRNA表達的變化。
　　 3、應用軟件分析BMP2基因轉錄調控區(qū)內可能的VDR結合位點，根據(jù)分析結果的基因序列，利用引物

9、設計軟件PrimerPremier5.0輔助設計相應的擴增引物。
　　 4、應用染色質免疫沉淀技術(ChromatinImmuno-Precipitation，ChIP)檢測VDR與BMP2轉錄調控區(qū)DNA的結合，應用方法3中獲得的擴增引物對ChIP產物進行PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳分析。
　　 5、克隆方法4中獲得的BMP2轉錄調控區(qū)內VDR結合位點的基因片段，構建含此基因片段的熒光素酶基因表達載體，通過熒光素酶

10、報告基因檢測系統(tǒng)分析此片段的轉錄活性。
　　 6、DNA甲基轉移酶抑制劑5-aza-2’-deoxycytidine(DAC)單獨或聯(lián)合1，25(OH)2D3處理體外培養(yǎng)的骨髓基質干細胞和UMR-106細胞，應用qRT-PCR檢測BMP2mRNA的表達變化。組蛋白去乙酰酶抑制劑trichostatinA(TSA)單獨或聯(lián)合1，25(OH)2D3處理細胞，應用qRT-PCR檢測BMP2mRNA的表達變化。
　　 7、1，2

11、5(OH)2D3處理UMR-106細胞后提取基因組DNA，應用重亞硫酸鹽焦磷酸測序法(Bisulfitepyrosequencing)檢測BMP2基因轉錄調控區(qū)CpG位點的甲基化狀態(tài)的改變。
　　 8、1，25(OH)2D3處理UMR-106細胞后，應用染色質免疫沉淀技術檢測BMP2轉錄調控區(qū)H3K9甲基化、組蛋白H3乙?；潭鹊母淖?。
　　 結果:
　　 1、GHS大鼠骨髓基質干細胞、腎臟和小腸中的維生素D受體

12、蛋白的水平較正常SD大鼠明顯增加，BMP2mRNA的表達較正常SD大鼠明顯降低。
　　 2、以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分別處理體外培養(yǎng)的SD大鼠和GHS大鼠骨髓基質干細胞6h、12h和24h，與空白對照組比較，BMP2mRNA的表達均明顯降低。以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分別處理培養(yǎng)的UMR-106細胞1h、6h、12h、24h和48h，與空白對照組比較，BMP2mRNA的表達均明顯降低。以不同

13、濃度的1，25(OH)2D3分別處理體外培養(yǎng)的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質干細胞和UMR-106細胞24h，與空白對照組比較，BMP2mRNA的表達均明顯降低。
　　 3、軟件分析了包括BMP2基因及其側翼序列在內的共計28，545bp的一段基因序列，共獲得8個可能存在的VDR結合位點(RegionA-H)。
　　 4、以VDR抗體進行ChIP實驗，將ChIP產物PCR擴增后，進行凝膠電泳分析顯示VDR能結合BMP2轉

14、錄調控區(qū)的RegionC片段。
　　 5、成功構建了pGL3-RegionC-promoter熒光素酶報告基因質粒，將其轉染入UMR-106細胞，結果顯示構建的pGL3-RegionC-promoter熒光素酶報告基因與空白對照的PGL3-promoter相比，表達活性顯著降低。1，25(OH)2D3的處理，使報告基因的熒光素酶表達活性進一步顯著降低。
　　 6、不同濃度(0.5，1，2umol/L)的DAC處理來源于G

15、HS大鼠的骨髓基質干細胞及UMR-106細胞后，均顯著上調BMP2mRNA的表達，僅有0.5umol/L的DAC上調來源于SD大鼠的骨髓基質干細胞中BMP2mRNA的表達。但是當與1，25(OH)2D3聯(lián)合使用時，與單獨1，25(OH)2D3處理組相比，較高濃度(1，2umol/L)的DAC均能顯著上調三種細胞中BMP2mRNA的表達。
　　 7、不同濃度（20，100，500nmol/L）的TSA處理來源于SD大鼠的骨髓基質干

16、細胞后，顯著上調BMP2mRNA的表達，而僅有20nmol/L的TSA上調來源于GHS大鼠的骨髓基質干細胞中BMP2mRNA的表達。當與1，25(OH)2D3聯(lián)合使用處理來源于SD和GHS大鼠的骨髓基質于細胞，以及UMR-106細胞時，與單獨1，25(OH)2D3處理組相比，較高濃度(100，500nmol/L)的TSA均能顯著上調BMP2mRNA的表達。
　　 8、1，25(OH)2D3處理后，重亞硫酸鹽測序顯示BMP2基因轉

17、錄調控區(qū)RegionC區(qū)域的一個CpG位點完全甲基化，而對照組同一CpG位點仍呈去甲基化狀態(tài)。
　　 9、染色質免疫沉淀技術檢測顯示1，25(OH)2D3處理UMR-106細胞后，提高了BMP2轉錄調控區(qū)RegionC區(qū)域H3K9甲基化的程度，顯著降低了BMP2轉錄調控區(qū)RegionC區(qū)域組蛋白H3乙?；某潭?。
　　 結論:
　　 1、在GHS大鼠的相同組織中，與正常SD大鼠比較，VDR水平升高而BMP2mRN