羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.從人足月胎盤羊膜中分離羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞，建立相應(yīng)培養(yǎng)體系，體外共培養(yǎng)兩種細(xì)胞探究?jī)烧叨S共培養(yǎng)中的相互影響關(guān)系。
　　2.分析鑒定羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）和羊膜上皮細(xì)胞(human amnion epithelial cells,hAEC)的干細(xì)胞特性以及羊膜上皮細(xì)胞作為組織工程皮膚表層種子細(xì)胞與人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞

2、的相似性。
　　3.通過(guò)三維氣液培養(yǎng)以羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚。
　　方法：取人足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤機(jī)械剖離羊膜，通過(guò)胰酶、膠原酶分步消化分離培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSC）、羊膜上皮細(xì)胞（hAEC)，通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)鑒定兩種細(xì)胞CD90等表型情況，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)基因CMYC等的表達(dá)情況以鑒定hAMSC與hAEC在基因表達(dá)水平的干細(xì)胞特性，同時(shí)RT-PCR檢測(cè)hAEC、hKRT19等基因的表達(dá)

3、，免疫熒光染色檢測(cè)hAEC K14的表達(dá)情況以鑒定其與人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的相似性同時(shí)說(shuō)明其作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的可行性。將兩種細(xì)胞按一定比例進(jìn)行二維混合培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，研究?jī)烧叨S共培養(yǎng)中的相互影響關(guān)系。最后以鼠I型膠原為基質(zhì)用兩種細(xì)胞氣液三維培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚，HE染色切片觀察。
　　結(jié)果：
　?。?）成功分離培養(yǎng)了hAMSC和hAEC，體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中hAEC生長(zhǎng)狀態(tài)良好具有較快的增殖速度，表型無(wú)明顯改變；

4、
　　（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)hAMSC和hAEC均高表達(dá)CD90、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34以及MHC-II類分子HLA-DR。RT-PCR檢測(cè)到hAMSC表達(dá)干細(xì)胞特性基因CMCY和NANOG，hAEC表達(dá)干細(xì)胞特性基因CMCY和KLF4，RT-PCR檢測(cè)hAMSC表達(dá)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞特性基因K19、β1-integrin、K8，hAEC表達(dá)K19、β1-integrin、K5、K8，免疫熒光染色見(jiàn)

5、hAEC表達(dá)與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖相關(guān)的的特性蛋白K14；
　　(3)通過(guò)氣液培養(yǎng)利用兩種細(xì)胞成功構(gòu)建組織工程皮膚，HE染色切片顯示其具有一定的皮膚結(jié)構(gòu)，且hAEC發(fā)生了初步分化。
　　結(jié)論：hAMSC與hAEC均有一定的干細(xì)胞特性，hAEC與皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞更具相似性，在特定條件下更易于分化為皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞。共培養(yǎng)結(jié)果顯示在三維工程皮膚的培養(yǎng)中生長(zhǎng)于基質(zhì)部分的hAMSC對(duì)表層的hAEC可以起到一定的滋養(yǎng)作用。本研究通過(guò)氣液培