HCV5’非翻譯區(qū)靶向性M1GS核酶構(gòu)建及其胞內(nèi)反義活性的研究.pdf

1、根據(jù)HCV基因組5’非翻譯區(qū)(5’UTR)的序列,借助計算機(jī)軟件模擬,設(shè)計并構(gòu)建了一組針對該區(qū)序列中不同靶位的人工M1GS核酶(M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67、M1GS-HCV/C76、M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160)。通過雙酶切、PCR及測序等方法證實,所構(gòu)建的這六種M1GS重組質(zhì)粒均克隆成功。此外,截取包括HCV5’UTR在內(nèi)的部分基因片段,將其成功插入至pGEM-

2、9z(f)質(zhì)粒的MCS中,構(gòu)建了含有底物DNA片段的另一個重組質(zhì)?！猵GEM-HC。分別將各M1GS重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與pGEM-HC質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體外混合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76三種人工核酶顯示出對底物RNA片段的切割活性,其中M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76活性相對較高,而M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160這

3、三種人工核酶則沒有明顯的切割活性。進(jìn)一步將體外初篩有效的三種M1GS核酶基因插入逆轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pLXSN中,構(gòu)建相應(yīng)的M1GS真核表達(dá)載體。與此同時,將HCV5’UTR的DNA片段插入至pGEF-N1質(zhì)粒的綠色熒光蛋白基因的上游,成功構(gòu)建了受控于HCV5’UTR的綠色熒光融合表達(dá)載體。再分別將各M1GS真核表達(dá)載體與該綠色熒光融合表達(dá)載體通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞(同時以表達(dá)紅色熒光蛋白的質(zhì)粒pDsRed2-C1作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)對照),建

4、立了一種有效的M1GS核酶胞內(nèi)復(fù)篩系統(tǒng)。通過熒光顯微觀察綠色熒光的變化,并進(jìn)一步通過Typhoon9200對各組細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn):核酶M1GS-HCV/C20和M1GS-HCV/C76可大大抑制綠色熒光蛋白的表達(dá),抑制率分別為77.54±1.97％和80.35±1.48%,而核酶M1GS-HCV/C67對綠色熒光的抑制作用則相對較弱,僅為58.82±0.88%。此外,實驗過程中還針對M1GS核酶與底物在體外進(jìn)行