表皮生長(zhǎng)因子對(duì)人毛囊外毛根鞘無(wú)色素性黑素細(xì)胞增殖、遷移能力的影響.pdf

1、目的:觀察不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growthfactor，EGF)對(duì)毛囊外毛根鞘(out root sheath，ORS)無(wú)色素性黑素細(xì)胞(amelanotic melanocytes，AMMCs)增殖能力及遷徙能力的影響。
　　方法:與頭皮提供者溝通獲得同意后。取頭皮并去除脂肪組織及真皮上1mm。采用1％分散酶Ⅱ消化獲得毛囊。再采用0.5％胰蛋白酶消化獲得外毛根鞘細(xì)胞。在含有經(jīng)Chelex100鈉形式螯合后

2、的胎牛血清的專用MCDB153培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)。采用差胰酶法傳代純化AMMC細(xì)胞。將純化并傳至第三代的細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)染色法鑒定其NKI/beteb與HMB-45的表達(dá)。將經(jīng)過(guò)純化和鑒定后的AMMC，根據(jù)EGF的作用濃隨機(jī)分為5組:0ng/ml（即空白對(duì)照組）、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml濃度EGF干預(yù)組。(1)按照分組條件采用不同濃度EGF干預(yù)AMMC48小時(shí)后。采用CCK8檢測(cè)法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖

3、能力。(2)將上述經(jīng)鑒定后的第三代的AMMC，用無(wú)血清MCDB153饑餓24 h后，采用Transwell體外小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度EGF干預(yù)AMMC48小時(shí)后各組細(xì)胞的遷移能力。所測(cè)得的結(jié)果用(x)±s統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用11.5版本的SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，行單因素方差分析。確定檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　結(jié)果:人毛囊外毛根鞘的無(wú)色素性黑素細(xì)胞在含有經(jīng)Chelex100鈉形式螯合后的胎牛血清以及各種添加因子的專用MCDB153培養(yǎng)基中可以

4、有效的擴(kuò)增。通過(guò)采用差胰酶法傳代 AMMC細(xì)胞可以有效的純化AMMC。AMMC在體外能夠連續(xù)、穩(wěn)定的傳代。傳至第三代的細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)染色顯示其NKI/beteb染色陽(yáng)性。HMB-45的染色為陰性。各組CCK8檢測(cè)的OD值:空白對(duì)照組0.1968±0.1763,1ng/ml EGF干預(yù)組0.2986±0.1773,10ng/ml EGF干預(yù)組0.6302±0.2292，20ng/ml EGF干預(yù)組0.7414±0.2177，50ng

5、/ml EGF干預(yù)組0.8198±0.2604。空白對(duì)照組的OD值低于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組（P均＜0.05）。1ng/ml EGF干預(yù)組的OD值低于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組（P均＜0.05）。空白對(duì)照組與1ng/ml EGF干預(yù)組的OD值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/m

6、l EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組OD值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。各組Transwell體外小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）:空白對(duì)照組5.88±2.03，1ng/ml EGF干預(yù)組6.75±2.71，10ng/ml EGF干預(yù)組22.50±5.71，20ng/ml EGF干預(yù)組54.75±6.54，50ng/ml EGF干預(yù)組55.75±6.30?？瞻讓?duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)少于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml

7、EGF干預(yù)組、50ng/mlEGF干預(yù)組（P均＜0.05）。1ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細(xì)胞數(shù)少于10ng/ml EGF干預(yù)組、20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組（P均＜0.05）。10ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細(xì)胞數(shù)少于20ng/ml EGF干預(yù)組、50ng/ml EGF干預(yù)組（P均＜0.05）。而20ng/ml EGF干預(yù)組與50ng/ml EGF干預(yù)組的遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。