Mycobacterium tuberculosis鐵載體合成相關(guān)基因Rv1345(fadD33)的過表達(dá)對宿主菌生理功能的影響研究.pdf

1、結(jié)核病至今仍是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球近1/3的人口感染過其致病菌--結(jié)核分枝桿菌。人們對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)進(jìn)行了廣泛研究，使得人類對結(jié)核病的控制取得了可喜的成績，一定程度上遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。然而由于醫(yī)患不規(guī)范不合理用藥、艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合感染、人口流動(dòng)的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行，使得近年來結(jié)核病疫情下降緩慢，在部分地區(qū)甚至有所回升。全球每年新發(fā)結(jié)核病數(shù)量仍在

2、增長，尤其是非洲地區(qū)、地中海東部和東南亞地區(qū)。當(dāng)前，在結(jié)核病控制工作中急需開發(fā)出有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)和開發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前科研領(lǐng)域最為關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 鐵離子是生命活動(dòng)的必需元素，是各種生命活動(dòng)重要酶的輔因子，如氧化酶、羥化酶、參與氧原子傳遞的酶等；參與氧化磷酸化和能量供應(yīng)的細(xì)胞色素也需要鐵離子。缺失鐵離子會(huì)導(dǎo)致重大的有機(jī)體生理功能缺陷。鐵離子對致病菌同樣重要。然而，宿主體內(nèi)，尤

3、其是胞內(nèi)，鐵離子很有限，因此，病原菌，如主要棲居在單核巨噬細(xì)胞中的結(jié)核菌，只有成功獲取宿主中的鐵離子才能成功感染和繁殖。
　　 鐵載體是一種小分子螯合劑，對鐵離子具有很高的親和力，是致病菌獲取鐵離子的重要工具。研究表明，鐵載體與微生物的存活和致病性密切相關(guān)。例如，在缺鐵環(huán)境中，缺失鐵載體的銅綠假單胞菌生長嚴(yán)重受抑，即使感染了燒傷小鼠，也不具有毒性；在巨噬細(xì)胞中，不能合成鐵載體分支菌素的結(jié)核分枝桿菌生長嚴(yán)重受抑制。此外，鐵載體的合

4、成還對分枝桿菌抗氧化壓力有關(guān)。鑒于鐵載體對MTB的重要作用，鐵載體已成為尋找抗結(jié)核藥物先導(dǎo)物的重要“模特”，已獲得了一些有潛力的抗菌/抑菌組分。
　　 結(jié)核分枝桿菌鐵載體有水溶性的羧化分支菌素和細(xì)胞壁相關(guān)的分支菌素兩種，前者被分泌到胞外掠奪宿主的鐵離子，轉(zhuǎn)遞給細(xì)胞壁上的分支菌素，再被轉(zhuǎn)遞進(jìn)胞內(nèi)滿足自身生理需要。結(jié)核分枝桿菌鐵載體的合成需要一系列酶的聯(lián)合作用。目前，雖然鐵載體生物合成的總體框架已經(jīng)勾勒出來，但結(jié)核分枝桿菌Rv134

5、4、fadD33和fadE14是否是分支菌素(mycobactin)生物合成基因簇成員尚存在爭議。
　　 Krithika等認(rèn)為Rv1345(FadD33)是結(jié)核分枝桿菌鐵載體生物合成酶之一，主要負(fù)責(zé)激活鐵載體尾鏈合成所需的脂肪酸基序。另外，有研究證明FadD33利于MTB在肝臟及肝癌細(xì)胞系中的生長和毒力。探索MTB FadD33對鐵載體合成和分泌的影響及其對宿主菌其他生理功能的影響，有助于完善對結(jié)核分枝桿菌鐵載體合成機(jī)制的認(rèn)識(shí)

6、，為抗結(jié)核藥物設(shè)計(jì)提供信息。
　　 本文主要將MTB H37Rv的分支菌素/羧化分支菌素合成基因fadD33(Rv1345)分別在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)并研究其對宿主菌的生長、抗氧化壓力、鐵載體分泌以及脂肪酸構(gòu)成的影響。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得M.tuberculosis H37Rv fadD33(Rv1345)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，以MTB H37Rv全基因組為模板，體外擴(kuò)增獲，得gadD33(Rv1345

7、)基因。Ⅰ)在Escherichia Coli中，我們通過TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector，然后亞克隆至載體pET32a(+)，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明pET32-Rv1345重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。接著，我們研究了過表達(dá)FadD33對E.Coli生長能力、抗H2O2能力和鐵載體分泌能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FadD33的過表達(dá)有利于重組大腸桿菌的生長，但是對E.Coli抗氧化壓力和鐵載體合成

8、分泌能力無顯著影響。Ⅱ)在M.smegmatisMC2155中，我們通過TA克隆將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector后，再克隆至穿梭質(zhì)粒pNIT-myc中，經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證以及測序證明重組質(zhì)粒pNIT-myc-Rv1345構(gòu)建成功。接著，我們研究了FadD33過表達(dá)對恥垢分枝桿菌抗氧化壓力、生長和鐵載體分泌的影響。最后，我們通過GC檢測了重組菌與空載對照的脂肪酸組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：FadD33過