肝癌肝移植預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物篩選及血清診斷預(yù)測(cè)模型建立.pdf

1、原位肝移植是治療肝細(xì)胞癌最有效的方法，因?yàn)楦我浦渤チ烁伟┌l(fā)生的根源，并且可以達(dá)到根治術(shù)的最大范圍。由于早期肝癌肝移植缺少明確的手術(shù)適應(yīng)癥，患者生存率令人失望，近幾年國(guó)內(nèi)外多個(gè)中心提出了受體選擇的標(biāo)準(zhǔn)，使肝癌肝移植術(shù)后生存率接近良性疾病，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)多是基于影像學(xué)檢查和病理形態(tài)學(xué)分級(jí)，不能完全反映腫瘤的生物學(xué)特性，對(duì)判斷預(yù)后的靈敏度和特異性還有待提高。 新興的蛋白組學(xué)，是對(duì)基因組所編碼的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的學(xué)科。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)使我

2、們對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有了更詳盡的理解，并能夠通過(guò)發(fā)現(xiàn)特異的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者預(yù)后和治療效果。 表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization，timeofflight，massspectroscopySELDI-TOF-MS)是蛋白質(zhì)組學(xué)新興運(yùn)用的技術(shù)，已有眾多的研究組利用該技術(shù)在患者體液中發(fā)現(xiàn)了能夠早期診斷腫瘤的標(biāo)志物。本課題研究目的就是希望在肝移植

3、患者的術(shù)前血清和腫瘤細(xì)胞中找到能夠預(yù)示患者預(yù)后的分子標(biāo)記物，并建立血清蛋白質(zhì)組的診斷和預(yù)測(cè)模型。 第一部分影響肝癌肝移植預(yù)后因素分析及復(fù)發(fā)的預(yù)防 本部分研究目的是分析影響肝癌肝移植預(yù)后的臨床病理因素，總結(jié)預(yù)防復(fù)發(fā)的措施，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)254例肝癌肝移植患者臨床病理特征進(jìn)行生存率、無(wú)瘤生存率的比較(單因素分析)，并使用Cox多因素分析得到有獨(dú)立意義的預(yù)后指標(biāo)。 結(jié)果： 1．254例肝癌肝移植患者

4、0．5年、1年、2年生存率為89．3％、79．4％、66．7％，無(wú)瘤生存率為85．6％、76．4％、71．6％。 2．單因素分析提示腫瘤大小、腫瘤侵犯血管程度、組織Edmondson分級(jí)、TNM分期、術(shù)前甲胎蛋白(AFP)影響患者無(wú)瘤生存率，并且前四個(gè)因素與患者生存率相關(guān)。 3．Cox多因素分析示腫瘤侵犯血管是影響患者生存和腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素。 第二部分蛋白質(zhì)芯片SELDI．TOF．MS技術(shù)平臺(tái)的建立 本

5、部分研究目的是建立蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)，選擇最優(yōu)化的試驗(yàn)條件。選擇肝癌肝移植患者術(shù)前血清和腫瘤細(xì)胞全蛋白裂解液各8例，采用弱陽(yáng)離子交換芯片(WCX2或CM10)、強(qiáng)陰離子交換芯片(SAX2)、固定金屬親和表面芯片(IMAC3)、反相疏水芯片(H4)四種蛋白質(zhì)芯片，經(jīng)SELDI-TOF-MS測(cè)定蛋白質(zhì)譜，篩選適合分析血清和組織細(xì)胞裂解液的最佳蛋白質(zhì)芯片，摸索芯片技術(shù)參數(shù)，評(píng)估該技術(shù)的穩(wěn)定性和可靠性。 結(jié)果：

6、 1．血清和腫瘤細(xì)胞經(jīng)四種芯片檢測(cè)出蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M／Z)一般在2000～30000范圍內(nèi)。 2．血清和腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜顯示峰最多的都是WCX2芯片。 3．同一芯片內(nèi)蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度的變異系數(shù)(CV)值為O．152，M／Z的CV值為0．0001。4．不同芯片間蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度的CV值為0．157，M／Z的CV值為0．0004。 第三部分與肝癌肝移植復(fù)發(fā)相關(guān)的腫瘤組織標(biāo)記物篩選 本部分研究目的：篩選肝腫瘤細(xì)

7、胞中與肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白，為進(jìn)一步尋找與預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物提供研究基礎(chǔ)，并作為第四部分血清蛋白研究的對(duì)照。通過(guò)選擇肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)患者組織標(biāo)本20例，無(wú)瘤生存患者22例，組織中提取的腫瘤細(xì)胞經(jīng)裂解后，利用WCX2蛋白質(zhì)芯片，建立腫瘤細(xì)胞全蛋白質(zhì)指紋圖譜，參數(shù)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度185，檢測(cè)器靈敏度8.檢測(cè)分子量范圍集中在2000～30000Da，BiomarkerWizard軟件比較兩組腫瘤細(xì)胞之間蛋白質(zhì)差異。

8、結(jié)果： 1.在M／Z2000～30000范圍內(nèi)，共檢測(cè)出101個(gè)蛋白峰，WCX2芯片建立的蛋白指紋圖譜中，復(fù)發(fā)和無(wú)瘤生存組相比較有35個(gè)蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2．復(fù)發(fā)組中蛋白上調(diào)26個(gè)，M／Z為2308、2495、2990、5994、3246、423l、2762、3746、6791、2948、2972、3112、3277、4263、413l、1690、6747、4560、6721、1791、2401、2

9、55l、7097、1854、3172、4046。 3．復(fù)發(fā)組中蛋白下調(diào)9個(gè)，M／Z為6171、1683、12323、7707、1994、5361、9621、10226、6332。 4．WCX2芯片篩選出的腫瘤細(xì)胞差異蛋白可能與腫瘤大小、腫瘤侵犯血管和移植前肝外微小轉(zhuǎn)移灶相關(guān)。 第四部分與肝癌肝移植復(fù)發(fā)相關(guān)的術(shù)前血清 生物標(biāo)記物篩選和診斷預(yù)測(cè)模型建立 本部分研究目的：篩選與肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的血

10、清生物標(biāo)記物并建立診斷預(yù)測(cè)模型；同時(shí)結(jié)合第三部分試驗(yàn)，觀察血清差異蛋白與腫瘤細(xì)胞差異蛋白有無(wú)聯(lián)系。通過(guò)收集107例肝癌肝移植患者術(shù)前血清，采用WCX2芯片為檢測(cè)介質(zhì)，參數(shù)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度185，檢測(cè)器靈敏度8，檢測(cè)分子量范圍集中在2000～30000Da，經(jīng)SELDI-TOF-MS測(cè)定得到蛋白質(zhì)譜，通過(guò)CiphergenProteinChipSoftware標(biāo)化，通過(guò)BiomarkerWizard軟件比較復(fù)發(fā)組和無(wú)瘤生存組間血清蛋白質(zhì)

11、差異，利用BiomarkerPatternsSystem軟件建立與移植術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的診斷預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行盲法驗(yàn)證。 結(jié)果： 1.對(duì)可能影響血清蛋白質(zhì)組變化的臨床病理特征進(jìn)行比較：兩組患者年齡、性別、術(shù)前治療、Child-Pugh分級(jí)、腎功能、腫瘤數(shù)目、組織學(xué)分化、包膜、AFP、術(shù)前肝炎狀態(tài)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而腫瘤大小、血管侵犯程度在兩組之間有明顯差異。 2．在M／Z2000～30000范圍內(nèi)，共檢測(cè)出11

12、5個(gè)蛋白峰，比較復(fù)發(fā)組與無(wú)瘤生存組血清蛋白質(zhì)圖譜，19個(gè)蛋白峰有顯著差異(P＜0.05)，M／Z為4897、4659、2146、2780、6784、5758、5530、4878、2832、2938、5634、6443、3517、3574的蛋白峰在復(fù)發(fā)組中上調(diào)，而M／Z為28123、2197、2476、2293、2236的蛋白峰在復(fù)發(fā)組中下調(diào)，術(shù)前血清差異蛋白峰與腫瘤細(xì)胞的差異蛋白峰沒(méi)有重復(fù)。 3．64例肝癌肝移植患者的血清蛋白譜

13、建立的復(fù)發(fā)決策樹(shù)判斷模型，由M／Z為4897、4659、2146、2780的4個(gè)蛋白峰組成，其敏感性為93．33％(28／30)，特異性為82．35％(28／34)。 4．對(duì)43例肝癌肝移植患者血清蛋白譜進(jìn)行盲法驗(yàn)證，該模型盲法驗(yàn)證靈敏性89．47％(17／19)，特異性83．33％(20／24)。 結(jié)論 1．通過(guò)多因素分析，腫瘤侵犯血管是影響肝癌肝移植患者預(yù)后最重要的危險(xiǎn)因素。臨床工作中迫切需要更多敏感、特異的

14、腫瘤標(biāo)志物來(lái)提高肝癌肝移植術(shù)前診斷的準(zhǔn)確性和了解患者的預(yù)后，如何在移植前發(fā)現(xiàn)肝外微小轉(zhuǎn)移將是未來(lái)工作的重點(diǎn)。 2．SELDI蛋白芯片技術(shù)具有快速、操作簡(jiǎn)便、樣品用量少和高通量等特點(diǎn)，其技術(shù)重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，是比較理想的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)：WCX2芯片對(duì)肝癌肝移植患者血清蛋白質(zhì)圖譜和腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜顯示蛋白峰較多且質(zhì)量較高，WCX2芯片可作為本研究的主要芯片。 3．由WCX2芯片篩選出的腫瘤細(xì)胞以及術(shù)前血清差異蛋白