多房棘球絳蟲重組Bb-EmⅡ-3-Em14-3-3疫苗構建及其免疫機制研究.pdf

1、目的：構建多房棘球絳蟲rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗；分析重組質粒pGEX-Em Ⅱ/3-Em14-3-3在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達效率；動態(tài)觀察rBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗皮下注射和鼻腔粘膜接種BALB/c小鼠產生的免疫應答；通過不同途徑接種rBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠，再用Em原頭節(jié)攻擊，研究疫苗產生的保護力及其免疫機制。從而為AE的防治提供一種有價值的疫苗。

2、 方法：通過PCR擴增Em Ⅱ/3和Em14-3-3抗原編碼基因序列，然后采用序貫PCR(gene SOEing)法將Em Ⅱ/3和Em14-3-3編碼基因用疏水甘氨酸接頭(Gly4Ser)3經(jīng)PCR擴增融合，定向克隆入大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-Em Ⅱ/3-Em14-3-3；用電穿孔法將該質粒導入BL21及Bb，構建多房棘球絳蟲重組Bb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗。SDS-PA

3、GE及Western blot分析pGEX-Em Ⅱ/3-Em14-3-3在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導表達的目的蛋白。為了研究rBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗皮下注射和鼻腔粘膜接種免疫BALB/c小鼠誘導的免疫應答類型及動態(tài)變化規(guī)律，將70只雌性BALB/c小鼠隨機分為2組，每組35只。皮下注射組：將5×106CFUrBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗懸浮于100μl PBS于小鼠背部皮下注射；鼻腔粘膜接種組：將5

4、×105CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗懸浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜單次接種。ELISA方法檢測各組鼠免疫后不同時間(免疫后0、2、4、6、8、10、12和14w)血清特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平以及脾細胞體外培養(yǎng)原液及在受到EmAg或ConA(LPS)刺激后分別產生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法檢測脾細胞增殖水平；用FCM檢測各組鼠免

5、疫后不同時間(免疫后0、2、4、6、8、10、12和14w)脾細胞CD4+和CD8+亞群。為了研究rBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠后抗原頭節(jié)攻擊產生的免疫保護力及其免疫機制，將78只雌性BALB/c小鼠隨機分為6組，每組13只。SC組：5×105CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗懸浮于100 μl PBS于小鼠背部皮下注射；IM組：5×106CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗懸浮

6、于100 μ1 PBS肌肉注射；IN組：5×105CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗懸浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜單次接種；PO組：1×108 CFU rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗懸浮于60μl PBS口服接種；Bb對照組：Bb菌液皮下注射；PBS對照組：100 μl PBS皮下注射。6組均于免疫12w后用Em原頭節(jié)攻擊。在Em原頭節(jié)攻擊感染后18w，用ELISA方法檢測各組鼠血清特異性IgG、IgG1、

7、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE水平；雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測各組鼠脾細胞體外培養(yǎng)原液及在受到EmAg或ConA(LPS)刺激后分別產生的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平；用MTT比色法檢測脾細胞增殖水平；用FCM檢測脾細胞CD4+和CD8+亞群及用Annexin V-FITC試劑盒檢測脾細胞原液或用ConA刺激培養(yǎng)時細胞凋亡發(fā)生率。 結果：瓊脂糖凝膠電泳證實PCR擴增的Em Ⅱ/3-Em14-3

8、-3融合基因全長2554bp，序列分析發(fā)現(xiàn)其與預期結果一致；雙酶切證實Em Ⅱ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中，成功構建能夠表達目的蛋白的重組質粒pGEX-Em Ⅱ/3-m14-3-3；將含50 μg/ml Amp的MRS瓊脂平板篩選的rBb經(jīng)PCR和質粒雙酶切鑒定分析，證實pGEX-Em Ⅱ/3-Em14-3-3成功轉進Bb，rBb-Em Ⅱ/3-Em14-3-3疫苗構建成功。SDS-PAGE及Western

9、blot分析重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導1～13h表達了119kDa的目的蛋白，占菌體總蛋白的20％，且能與鼠血清抗體發(fā)生特異性結合。動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)2組特異性抗體IgG、IgG2a和IgG2b都在免疫后有不同程度的增高；而IgG1和IgG3無明顯變化；IgE在免疫后10～12w達較高水平；淋巴細胞增殖在免疫后10～14w達較高水平；2組CD4+T細胞均在免疫后4～8w升高，而CD8+T細胞輕微增加；2組小鼠脾細胞原

10、液或受EmAg和ConA刺激后，4種細胞因子在免疫后2～6w之間達高水平，其中以IFN-γ和TNF-α增加明顯。疫苗免疫及原頭節(jié)攻擊后發(fā)現(xiàn)與PBS對照組相比，皮下注射組、肌肉注射組、鼻腔粘膜接種組和口服接種組小鼠檢獲泡球蚴質量均降低，減蚴率為13.56～78.25％，皮下注射組的減蚴率最高；免疫組IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平與PBS對照組相比顯著增加，皮下注射組IgG、IgG2a和IgG2b水平明顯高于其他免疫組，各免疫

11、組IgG3和IgE水平降低；各免疫組小鼠脾細胞原液、EmAg刺激或ConA刺激后淋巴細胞增殖指數(shù)均顯著高于PBS對照組；各免疫組CD4+亞群水平顯著高于PBS對照組，CD8+亞群水平較PBS對照組增加，但無顯著差異；與PBS對照組相比，各免疫組小鼠脾細胞IL-12、IFN-γ和TNF-α水平不同程度升高，IL-10水平降低；各免疫組小鼠脾細胞原液或ConA刺激后脾細胞凋亡發(fā)生率明顯低于PBS對照組，皮下注射組脾細胞凋亡發(fā)生率最低。

12、 結論：1.通過序貫PCR成功擴增出EmII/3-Em14-3-3融合基因。2.成功構建了多房棘球絳蟲重組質粒pGEX-Em II/3-Em14-3-3及rBb-EmII/3-m14-3-3疫苗。3.多房棘球絳蟲重組質粒pGEX-Em II/3-Em14-3-3能在BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達，表達效率為20％，并且表達的Em II/3-Em14-3-3重組蛋白具有特異的抗原性。4.rBb-Em II/3-Em14-3-3疫