多房棘球蚴Em95基因克隆、原核表達(dá)及應(yīng)用.pdf

1、多房棘球蚴病俗稱(chēng)泡球蚴病是由多房棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)（多房棘球蚴、泡球蚴）寄生于人或動(dòng)物肝臟所引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病，它的成蟲(chóng)主要寄生于狐貍、狼和犬的小腸內(nèi)。本病主要在北半球高緯度地區(qū)和凍土地帶流行，但隨著世界貿(mào)易和全球化進(jìn)程的推進(jìn)，該病有向南半球蔓延的趨勢(shì)。它不僅能?chē)?yán)重危害人體的健康，而且還是一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。目前，對(duì)于該病的治療主要是以手術(shù)切除為主，藥物治療為輔，但是由于泡球蚴呈腫瘤樣無(wú)限浸潤(rùn)生長(zhǎng)，手術(shù)切除后能發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此對(duì)泡

2、球蚴病的預(yù)防成為流行區(qū)各級(jí)政府所優(yōu)先關(guān)心的問(wèn)題。研究多房棘球絳蟲(chóng)保護(hù)性抗原EM95的免疫保護(hù)作用對(duì)泡球蚴病疫苗研制與開(kāi)發(fā)具有十分重要的意義。
　　本研究以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Em95基因序列作為參考序列設(shè)計(jì)引物，以多房棘球蚴總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Em95基因完整ORF序列，并對(duì)該序列進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，EM95蛋白的編碼基因長(zhǎng)471bp，與參考序列的相似性為100％，由156個(gè)氨基酸殘基組成，其上

3、有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，N端有一長(zhǎng)為16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，C端有由23個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū)，屬于分泌型糖蛋白。B細(xì)胞抗原表位分析表明，EM95有6個(gè)潛在的抗原表位，比EG95預(yù)測(cè)的抗原表位少一個(gè)。將全長(zhǎng)的Em95基因和截去編碼信號(hào)肽及跨膜區(qū)的Em95基因分別克隆到原核表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，用IPTG誘導(dǎo)使其表達(dá)。結(jié)果表明，全長(zhǎng)的Em95基因以包涵體形式表達(dá)，而截去信號(hào)肽及跨膜區(qū)的Em95基因（tEm95

4、）以可溶性蛋白形式表達(dá)。將純化后的tEM95重組蛋白免疫BALB/c小鼠（雌性，6周齡），小鼠分為免疫組（首免50μg，以后減半，40只）、佐劑組（40只）和對(duì)照組（40只），三次免疫兩周后腹腔接種多房棘球蚴原頭蚴（100個(gè)/只）進(jìn)行攻擊感染，9周后對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行剖檢，結(jié)果表明EM95重組蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)率為27.58％，減蚴率為60.52％～67.38％。結(jié)論認(rèn)為，EM95重組蛋白對(duì)繼發(fā)性多房棘球蚴病具有一定的保護(hù)作用，能明顯抑制多房