PGE1改善高糖聯(lián)合TNF-α損傷大鼠腎小球系膜細胞及機制研究.pdf

1、背景：
　　 隨著全球經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平不斷提高，大家在享受豐富物質(zhì)生活帶來的便利時，面臨的健康威脅也日益嚴重。糖尿病(diabetes mellitus，DM)正是在這樣一個生活方式現(xiàn)代化而人口老齡化的時代以驚人的速度攀升，成為患病率、致殘率及死亡率僅次于腫瘤和心血管疾病成為第三大慢性非傳染病，給社會公共健康帶來嚴峻的考驗。如若不控制糖尿病發(fā)病率逐年增長的勢頭，預(yù)計到2050年，全球糖尿病患者數(shù)量將有一到兩倍的增加，同時

2、由DM病程進展所致的各種慢性并發(fā)癥包括糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheralneuropathy，DPN)、糖尿病心腦血管并發(fā)癥等也將大幅度增長，從而帶來難以預(yù)計的社會及經(jīng)濟負擔(dān)。糖尿病腎病作為糖尿病特有的慢性微血管并發(fā)癥，現(xiàn)今已成為糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是目前歐美終末期腎病(e

3、nd-stagerenal disease，ESRD)最常見的病因，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，目前約30％的1型糖尿病及20％～50％的2型糖尿病患者發(fā)生腎臟損害，而進展至ESRD的患者5年生存率將小于20％。
　　 DN早期的病理改變包括細胞外基質(zhì)合成增多和排除減少導(dǎo)致的腎小球基底膜增厚、細胞外基質(zhì)沉積和系膜細胞增生所致的系膜區(qū)擴張以及足細胞損害和數(shù)量的減少，加上腎小管間質(zhì)擴張和小管間質(zhì)細胞外基質(zhì)積聚，隨即會出現(xiàn)蛋白尿及腎

4、小球濾過率的降低，從而共同加劇腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，最終進展為ESRD。腎小球的病理變化主要有三種類型，包括結(jié)節(jié)性腎小球硬化、彌漫性腎小球硬化和滲出性病變，其中以結(jié)節(jié)性腎小球硬化最具特征性，又將其稱為毛細血管間腎小球硬化或Kimnel-Steil-Wilson結(jié)節(jié)（K-W結(jié)節(jié)）。由此可見，系膜細胞在糖尿病腎病發(fā)病初期就出現(xiàn)改變，并進一步引發(fā)疾病進展過程中的組織病理異常和功能障礙甚至衰竭，在DN的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)著極為重要的角色。<

5、br>　　 DN是由環(huán)境和遺傳因素相互作用所致的多因素紊亂，確切的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前研究發(fā)現(xiàn)較經(jīng)典的機制概括來說主要包括兩大方面，即代謝損傷和血流動力學(xué)損傷，具體來說有以下致病因素:1、高血糖引起的多種生化代謝異常，包括非酶糖基化作用的加強、多元醇通路和己糖胺生物合成通路的激活，以及葡萄糖直接改變細胞內(nèi)信號通路而發(fā)揮的毒性作用等;2、高血壓引起的腎小球損傷;3、蛋白尿影響，蛋白質(zhì)的超負荷誘導(dǎo)小管間質(zhì)損害，誘發(fā)促進硬化的細胞因子

6、釋放，從而促進疾病的進展;4、分子介質(zhì)包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的影響，以及轉(zhuǎn)錄因子和細胞內(nèi)信號通路的參與;5、此外，DN被證實具有遺傳易感性。
　　 近年來，學(xué)者們在上述經(jīng)典的發(fā)病機制外，越來越關(guān)注“代謝性炎癥”在DM及其慢性并發(fā)癥中的參與程度，并致力于探索與DN相關(guān)的炎癥因子和信號通路。關(guān)于炎癥與代謝疾病相關(guān)研究最早始于二十世紀(jì)90年代，但直到2006

7、年Hotamisiligil在《Nature》上才首次定義這一概念，并闡述了參與糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，他指出代謝性炎癥是指一種代謝誘發(fā)的長期而持續(xù)的低強度炎癥反應(yīng)，主要由長期的慢性營養(yǎng)過剩狀態(tài)以及TNF-α過表達而使正常胰島素信號通路受抑制所觸發(fā)，雖然其臨床癥狀有別于傳統(tǒng)的急性炎癥的表現(xiàn)包括紅、腫、熱、痛等，但其分子機制和信號通路與傳統(tǒng)的炎癥反應(yīng)相類似。在這之后，越來越多的研究開始致力于炎癥在糖尿病及其慢性并發(fā)癥中參與程度和

8、具體機制。有研究證實免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程不可缺少的致病因素，參與其中的炎癥細胞眾多，包括白細胞、單核細胞、巨噬細胞等，而細胞因子更甚，包括單核細胞趨化因子(MCP-1)、細胞間粘附因子（ICAM-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)以及核因子-κB(NF-κB)等，這些細胞及細胞因子參與并貫穿疾病始末。
　　 再眾多的細胞因子當(dāng)中，MCP-1、TGF-β1及IL-

9、6是與DN發(fā)生發(fā)展最為密切的炎癥因子，在疾病過程中它們即有各自獨立的作用也相互交聯(lián)共同加速了DN進程。MCP-1在絕大多數(shù)細胞包括系膜細胞和單核細胞中表達，對單核及巨噬細胞具有很強的趨化活性。既往研究證明，無論在糖尿病腎病動物模型，亦或糖尿病腎病患者的尿液及血液中，MCP-1的表達水平均是明顯增高的，高水平的MCP-1能夠誘導(dǎo)炎癥細胞在腎臟組織的浸潤來引起腎功能的損害。TGF-β1是DN中另一個重要的細胞因子，既往認為對糖尿病腎小球硬化

10、的過程有極為關(guān)鍵的作用，TGF-β1具有促進硬化的重要特征，誘導(dǎo)細胞肥大和凋亡。體外研究也證實，TGF-β1能夠增加腎小球系膜細胞和小管上皮細胞膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白的合成，同時還可抑制膠原酶的合成，刺激金屬蛋白抑制劑產(chǎn)生，使細胞外基質(zhì)降解減少，加劇基質(zhì)積聚;然而除了致纖維化以外，同時也具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的功能，在腎臟，TGF-β1能夠上調(diào)MCP-1和IL-8等炎癥因子的表達，促進腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，糖尿病患者腎小

11、球損害的嚴重程度與腎小球系膜細胞和足細胞中IL-6 mRNA的表達程度相關(guān)，提示IL-6可能對這些細胞外基質(zhì)分泌有促進作用。此外，近期許多研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腎小球基底膜增厚程度與IL-6的水平有著密切的關(guān)系，而腎小球基底膜增厚被認為是評判糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中強有力的指標(biāo)。因此可以認為IL-6對DN的發(fā)展也有預(yù)測作用。
　　 核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄

12、因子，是系膜細胞表達多種免疫炎癥相關(guān)基因的調(diào)控樞紐，與系膜細胞增殖和分泌炎癥因子密切相關(guān)。NF-κB一般以同源或異源二聚體形式存在，在靜息狀態(tài)下以非共價鍵的形式與IκB形成復(fù)合體散在于胞漿中，受到多種因素刺激后，通過IκBs降解從而活化NF-κB，復(fù)合體解聚而轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，繼而介導(dǎo)下游一系列反應(yīng)。NF-κB能夠促進多種細胞粘附分子和細胞因子mRNA合成，在基因早期應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。研究顯示，NF-κB介導(dǎo)了牽張刺激及高糖誘導(dǎo)的系

13、膜細胞MCP-1產(chǎn)生，同時還參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)TGF-β1信號通路。這些初步證據(jù)顯示，NF-κB極有可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)來參與糖尿病腎小球損傷的發(fā)病，同時，能夠抑制NF-κB通路激活以達到抗炎作用的藥物將得到廣泛的開發(fā)。
　　 目前，干預(yù)糖尿病腎病進展的方法除了嚴格的血糖控制、低蛋白飲食、血壓控制（特別是ACEI和/或ARB藥物物的使用）外，改善細胞內(nèi)高凝狀態(tài)也是重要的治療方案。基于此目的，前列腺素E1(PGE1)等抗血小板藥物或抗

14、凝藥得到了廣泛的應(yīng)用。李鵬飛等應(yīng)用PGE1治療不同分期的DN患者并隨訪1年發(fā)現(xiàn)，短期應(yīng)用PGE1能夠迅速降低各期患者的尿白蛋白水平，甚至是Ⅳ期和Ⅴ期的DN患者尿白蛋白也出現(xiàn)了不同程度的降低。在此之外，還有研究發(fā)現(xiàn)PGE1在降低DN患者尿蛋白排泄率的同時，血循環(huán)中炎癥因子CRP、ICAM-1等均有所降低，提示PGE1在改善血流動力學(xué)及改善微循環(huán)之外，可能有一定改善炎癥反應(yīng)的作用，但是這一作用是否與改善微循環(huán)引起全身炎癥狀態(tài)的改變有關(guān)，或是

15、PGE1對腎臟局部也有作用，在這些研究中并未探討。于是隨后大量的體外實驗開始研究PGE1在腎臟局部的作用。Dell等運用PGE1處理大鼠系膜細胞后發(fā)現(xiàn)，低劑量的PGE1能夠抑制環(huán)孢素A誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞PAI-1的表達。隨后他在體外實驗中又發(fā)現(xiàn)PGE1能降低環(huán)孢素A誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞TGF-β1 mRNA的表達，而M.Kishida等觀察到PGE1能抑制TNF-α誘導(dǎo)的人系膜細胞表達PAI-1，提示PGE1在糖尿病腎病引起的腎小球硬化癥

16、中有治療意義。至此，PGE1能夠改善腎臟纖維化越來越明確，但是否對腎臟局部炎癥因子表達有作用有待進一步研究。
　　 因此，本研究旨在探討PGE1對高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞株（HBZY-1）損傷的保護作用，并探討其可能的機制。選取HBZY-1細胞株作為研究對象，觀察高糖聯(lián)合TNF-α對細胞增殖的影響，并同時從蛋白和基因水平上觀察炎癥因子包括MCP-1、TGF-β1和IL-6表達水平;而加用不同濃度的PGE1處理后

17、，是否能夠抑制細胞增殖和上述炎癥因子的表達;同時將進一步探討以上抑制作用產(chǎn)生的可能機制，以期為臨床上PGE1治療糖尿病腎病提供依據(jù)。
　　 具體研究內(nèi)容分為以下兩個部分:
　　 第一章、PGE1改善高糖聯(lián)合TNF-α損傷大鼠腎小球系膜細胞
　　 目的：觀察PGE1對高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞損傷的保護作用。
　　 方法：
　　 1、實驗對象:選取大鼠腎小球系膜細胞株(HBZY-1)

18、作為研究對象，用含10％胎牛血清的DMEM（正糖）完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)體外培養(yǎng)，每3天傳代一次。
　　 2、實驗分組:
　　 根據(jù)實驗設(shè)計分為以下處理組:
　　 NG組:正糖(5.6mmol/L)對照組;
　　 HT組:高糖(30mmol/L)+TNF-α（10ng/mL）處理組;
　　 HTP1組:高糖（30mmol/L）+TNF-α（10ng/mL）+PGE1(

19、0.01ng/mL)處理組;
　　 HTP2組:高糖（30mmol/L）+TNF-α(10ng/mL)+PGE1(0.05ng/mL)處理組;
　　 HTP3組:高糖(30mmol/L)+TNF-α(10ng/mL)+PGE1(0.1ng/mL)處理組;
　　 HTP4組:高糖(30mmol/L)+TNF-α（10ng/mL）+PGE1(0.5ng/mL)處理組;
　　 HTP5組:高糖(30mmol/L

20、)+TNF-α（10ng/mL）+PGE1(1ng/mL)處理組。
　　 各組在正式干預(yù)HBZY-1細胞前均先用含0.5％胎牛血清的DMEM（正糖）完全培養(yǎng)基饑餓24h，使細胞同步化于靜止期。
　　 3、實驗方法:
　　 四甲基偶氮鹽滲入法（MTT法）:測定各組HBZY-1細胞光密度值(optical density，OD)，評價細胞增殖水平。
　　 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）:測定HBZY-1細胞培

21、養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1及IL-6蛋白濃度;
　　 實時熒光定量PCR法（qRT-PCR法）:測定HBZY-1細胞MCP-1、TGF-β1及IL-6mRNA表達情況;
　　 4、統(tǒng)計方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，任意兩組間比較當(dāng)滿足方差齊性時采用LSD法(Least-significant dif

22、ference test)，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、PGE1對高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HBZY-1細胞增殖的影響:
　　 與正糖組相比，在培養(yǎng)至48h以內(nèi)高糖聯(lián)合TNF-α均能明顯促進HBZY-1細胞的增殖(0.704±0.096 vs.0.840±0.040;0.789±0.104 vs.1.122±0.136)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

23、(P=0.004;P=0.001)。
　　 與高糖組相比，在作用24h時，低濃度的PGE1（0.01、0.05及0.1ng/mL）對細胞增殖抑制作用不明顯，差異不具統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而較高濃度的PGE1（0.5及1ng/mL）能夠顯著降低細胞OD值（0.708±0.095 vs.0.840±0.040;0.687±0.082 vs.0.840±0.040），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005; P=0.002);隨著培

24、養(yǎng)時間延長至48h，除HTP1組外，其余藥物濃度組較高糖組細胞OD值均明顯下降（0.862±0.239 vs.1.122±0.136;0.800±0.211 vs.1.122±0.136;0.720±0.146vs.1.122±0.136;0.678±0.137 vs.1.122±0.136），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.10;P=0.002; P=0.000;P=0.000)。
　　 2、PGE1對高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的HB

25、ZY-1細胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1、IL-6蛋白含量的影響:
　　 2.1、各組MCP-1蛋白濃度的比較:
　　 與NG組相比，處理的48h以內(nèi)HT組HBZY-1培養(yǎng)上清液中的MCP-1蛋白濃度均顯著增加（51.639±6.699 vs.79.932±17.543，82.159±5.389 vs.151.353±12.229），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030;P=0.000)。
　　 與HT組相

26、比，24h時藥物處理組與HT組相比未出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05);培養(yǎng)時間延長至48h時，較高濃度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明顯降低MCP-1蛋白濃度（117.171±25.589 vs.151.353±12.229;114.302±14.611 vs.151.353±12.229），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014;P=0.009);而較低濃度的PGE1（0.05、0.1ng/mL）作用不明顯，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0

27、.05)。
　　 2.2、各組TGF-β1蛋白濃度的比較:
　　 與NG組相比，24h時HT組細胞上清液中TGF-β1蛋白濃度變化不明顯，統(tǒng)計學(xué)未見明顯差異(P＞0.05)，48h時，HT組細胞上清液中的TGF-β1蛋白濃度顯著增加（644.939±97.461 vs.947.349±144.847），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004):
　　 與HT組相比，24h時各PGE1處理組細胞上清液中的TGF-β1蛋

28、白濃度無明顯下降，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);48h時，較高濃度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明顯降低TGF-β1蛋白濃度(709.691±130.684 vs.947.349±144.847;615.691±75.904 vs.947.349±144.847)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017;P=0.002)，而較低濃度的PGE1(0.05、0.1ng/mL)組的抑制作用不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)

29、。
　　 2.3、各組IL-6蛋白濃度的比較:
　　 試劑盒檢測結(jié)果顯示，各組OD值均低于最低濃度標(biāo)準(zhǔn)品（0.312pg/ml）的OD值，認為在培養(yǎng)48h內(nèi)上清液中未檢測到IL-6。
　　 3、PGE1對高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)HBZY-1細胞MCP-1、TGF-β1、IL-6 mRNA表達的影響:
　　 3.1、各組MCP-1 mRNA表達水平的比較:
　　 與NG組相比，HT組MCP-1 mRN

30、A的表達顯著增加（0.240±0.056 vs.1.000±0.207），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000):
　　 與HT組相比，較低濃度的PGE1（0.05，0.1ng/mL）的抑制作用不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，較高濃度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明顯抑制MCP-1 mRNA的表達（0.736±0.073 vs.1.000±0.207,0.656±0.107 vs.1.000±0.207），差異

31、具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049;P=0.015)。
　　 3.2、各組TGF-β1 mRNA表達水平的比較:
　　 與NG組相比，HT組TGF-β1 mRNA的表達明顯增加（0.429±0.150 vs.1.000±0.202），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002);
　　 與HT組相比，較低濃度的PGE1(0.05，0.1ng/mL)的抑制作用不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，較高濃度的PGE1（0

32、.5及1ng/mL）可明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達（0.702±0.095 vs.1.000±0.202;0.671±0.113 vs.1.000±0.202），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039;P=0.025)。
　　 3.3、各組IL-6 mRNA表達水平的比較:
　　 與NG組相比，HT組IL-6 mRNA的表達明顯增加（0.436±0.044 vs.1.000±0.221），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.

33、001);
　　 與HT組相比，低濃度的PGE1(0.05，0.1，0.5ng/mL)的抑制作用不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，高濃度的PGE1(1ng/mL)可明顯抑制IL-6mRNA的表達（0.701±0.027 vs.1.000±0.221），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。
　　 結(jié)論：
　　 1、體外模擬高糖聯(lián)合TNF-α環(huán)境下，48h內(nèi)大鼠系膜細胞均出現(xiàn)明顯的增殖，且隨著時間延長增

34、殖越來越明顯;而一定濃度的PGE1能抑制其增殖。
　　 2、高糖聯(lián)合TNF-α環(huán)境能誘導(dǎo)大鼠系膜細胞細胞分泌MCP-1以及TGF-β1蛋白，較高濃度的PGE1能抑制大鼠系膜細胞MCP-1以及TGF-β1蛋白的分泌。
　　 3、高糖聯(lián)合TNF-α環(huán)境能誘導(dǎo)大鼠系膜細胞細胞MCP-1、TGF-β1以及IL-6mRNA分泌，較高濃度的PGE1能抑制大鼠系膜細胞MCP-1、TGF-β1以及IL-6mRNA的表達。
　　

35、第二章、PGE1改善高糖聯(lián)合TNF-α損傷大鼠腎小球系膜細胞的機制
　　 目的：探討PGE1改善高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞損傷的潛在機制。
　　 方法：
　　 1、實驗對象:選取大鼠腎小球系膜細胞細胞株(HBZY-1)作為研究對象，采用含10％胎牛血清的DMEM（正糖）完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)體外培養(yǎng)，每3天傳代一次。
　　 2、實驗分組:
　　 根據(jù)實驗

36、設(shè)計分為以下處理組:
　　 NG組:正糖(5.6mmol/L)對照組;
　　 HT組:高糖（30mmol/L）+TNF-α(10ng/mL)處理組;
　　 HTP5組:高糖(30mmol/L)+TNF-α(10ng/mL)+PGE1（1ng/mL）處理組。
　　 各組在正式干預(yù)細胞前均采用含0.5％胎牛血清的DMEM（正糖）完全培養(yǎng)基饑餓24h，使細胞同步于靜止期。
　　 4、實驗方法:
　

37、　 細胞免疫熒光法:檢測細胞內(nèi)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況。
　　 結(jié)果：
　　 與NG對照組相比，高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的細胞核NF-κB p65熒光強度明顯增強;與HT組相比，HTP5組的細胞核內(nèi)NF-κB p65熒光強度明顯減弱。
　　 結(jié)論：
　　 高糖聯(lián)合TNF-α可誘導(dǎo)HBZY-1細胞內(nèi)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位;PGE1能夠抑制高糖聯(lián)合TNF-α誘導(dǎo)的HBZY-1細胞的NF-κB p65核轉(zhuǎn)