HBsAg定量在慢性HBV感染者肝纖維化預測中的價值及二甲雙胍對HBsAg表達的抑制和初步機制.pdf

1、作為乙型肝炎病毒(HBV)的外膜蛋白，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清檢測是確立HBV感染診斷的傳統(tǒng)標志物，隨著檢測技術的改進和基礎研究的深入，血清HBsAg定量檢測及其臨床意義已成為乙肝研究領域的熱點之一?，F(xiàn)已明確，血清HBsAg可間接反映肝內共價閉合環(huán)狀DNA數(shù)量和轉錄活性，其血清學水平與HBV慢性感染自然史密切相關，有助于區(qū)分乙肝e抗原(HBeAg)陰性慢性乙型肝炎(CHB)與非活動性HBsAg攜帶者，也能幫助預測抗病毒藥物尤其

2、是干擾素(IFN)治療的持久病毒學應答，但受HBsAg定量檢測方法和肝活檢技術普及不夠的影響，其與肝臟病理尤其是肝纖維化間的關聯(lián)如何、能否作為肝纖維化無創(chuàng)診斷的血清標志物尚不清楚。另外一個來自HBsAg的挑戰(zhàn)是，目前臨床使用的兩類抗病毒藥核苷（酸）類似物(NUCs)和兼有免疫調節(jié)作用的IFNs對HBsAg作用非常有限一作為理想的抗病毒治療目標，HBsAg血清學陰轉在臨床實踐中通常很難實現(xiàn)（1年抗病毒治療＜7％），尋找能降低HBsAg水平

3、的新藥或兼有降低HBsAg作用的抗HBV藥物是抗HBV新藥研究迫切需要解決的問題之一，但目前只有幾種四氫-四唑-并嘧啶衍生物在實驗研究中顯示出特異性抑制HBsAg分泌的作用。借助宿主肝細胞代謝-病毒間相互作用進行HBV基因組轉錄調控的干預措施似乎在這一方面具有一定優(yōu)勢，尤其是現(xiàn)有相關臨床藥物的老藥新用開發(fā)。因此，本研究以血清HBsAg定量在肝纖維化無創(chuàng)診斷中的臨床意義和降低HBsAg水平的新藥研究為中心進行設計，分成血清HBsAg定量檢

4、測在HBeAg陽性慢性HBV感染者顯著性和進展性肝纖維化預測中的價值、二甲雙胍對HBsAg表達和HBV復制影響的體外研究和二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機制研究等三部分進行實施，主要目的在于:1）探討血清HBsAg定量檢測在HBeAg陽性慢性HBV感染者肝纖維化無創(chuàng)診斷中的可能臨床價值;2）從肝臟代謝調控入手，觀察傳統(tǒng)口服降糖藥二甲雙胍在HBV穩(wěn)定轉染和瞬時轉染細胞模型中對HBsAg表達和HBV復制的影響;3）從宿主肝細胞AMP活化蛋

5、白激酶(AMPK)和HBV基因組啟動子/增強子轉錄活性兩方面初步探討二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機制，為擴充血清HBsAg定量檢測的臨床意義提供新的觀察依據(jù)，為尋找降低HBsAg水平的新的治療選擇提供新的思路。
　　在第一部分工作中，我們收集了一組有組織學證實的HBeAg陽性HBV慢性感染者(n=197)的臨床和病理資料，分析了血清HBsAg水平與肝臟病理間的聯(lián)系，并與兩個較常用的肝病病因非特異無創(chuàng)診斷模型FIB-4和APRI

6、相比較，重點評價了血清定量HBsAg(qHBsAg)或基于qHBsAg建立的簡易模型在顯著性和進展性肝纖維化預測中的價值。血清qHBsAg采用ArchitectHBsAgQT商業(yè)化試劑盒以免疫化學發(fā)光法在ARCHITECTi2000全自動免疫分析儀上檢測;肝臟纖維化分期采用Scheuer，s分類標準，顯著性肝纖維化定義為F2～F4，進展性肝纖維化定義為F3～F4;基于qHBsAg建立的纖維化無創(chuàng)評估模型來自對建模隊列（隨機獲取研究對象總

7、體的60％生成）的多元分析，并在驗證隊列即其余40％人群中進行診斷效力的驗證;以受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)計算所用模型的診斷準確性。結果發(fā)現(xiàn):1）血清HBsAg水平與HBeAg陽性HBV慢性感染者肝纖維化分期呈明顯的負相關，是預測顯著性和進展性肝纖維化存在的獨立因子;2）基于血清qHBsAg建立的簡易模型，尤其是與GGT聯(lián)合組成的GqHBsR，可以較準確和特異地識別HBeAg陽性HBV慢性感染者的顯著性肝纖維化，當診斷

8、界值取7.78時診斷準確性52.7％，在整個研究人群中預測顯著性肝纖維化的敏感性78.6％、特異性74.1％、陽性預測值(PPV)80％、陰性預測值72.4％，在我們的研究隊列中，可減少約80％的肝活檢需求;3）GqHBsR計分為8.84時診斷進展性肝纖維化的準確性最高(56.1％)，在整個研究人群中預測進展性肝纖維化的敏感性83.3％、特異性66.4％;4）與目前較常用的肝病病因非特異性無創(chuàng)預測模型APRI和FIB-4相比，模型GqH

9、BsR的診斷準確性明顯提高，并且具有不可替代的特異性、簡單易獲得和高PPV等優(yōu)點，無論是診斷還是排除顯著性/進展性肝纖維化都具有較大臨床價值。因此血清qHBsAg為HBeAg陽性HBV慢性感染人群的顯著性或進展性肝纖維化預測提供了一個簡單實用的臨床評估工具。
　　在第二部分工作中，我們在體外實驗中比較了幾個臨床常用肝臟代謝調節(jié)藥（二甲雙胍、吡格列酮、阿托伐他汀和辛伐他?。φ嫌蠬BV基因組的穩(wěn)定細胞系HepG2.2.15細胞培養(yǎng)

10、上清液HBsAg表達的影響后，重點觀察了傳統(tǒng)口服降糖藥二甲雙胍對HBsAg表達和HBV復制的抑制作用。胞外和胞內HBsAg均采用ArchitectHBsAgQT商業(yè)化試劑盒以免疫化學發(fā)光法在ARCHITECTi2000全自動免疫分析儀上定量以便于抑制效果的比較;同法測定細胞培養(yǎng)上清液HBeAg表達;熒光定量PCR法檢測胞外HBVDNA;Southernblot檢測胞內HBV復制中間體。結果發(fā)現(xiàn):1）在HBV感染體外模型中，肝臟代謝調節(jié)類

11、藥物確實可以一定程度實現(xiàn)HBsAg表達的下調，但其效應并不一致，在所選的幾個臨床常用藥物中，二甲雙胍抑制HepG2.2.15細胞胞外HBsAg表達的作用似乎最強;2)隨后進行的系統(tǒng)研究表明二甲雙胍能明顯抑制HBsAg生成并中等度抑制HBV復制和HBeAg表達，無論是在HBV穩(wěn)定轉染還是瞬時轉染HepG2細胞模型中;3）根據(jù)HBsAg定量結果計算二甲雙胍抑制HepG2.2.15細胞胞外和胞內HBsAg表達的半數(shù)有效劑量(EC50)分別為2

12、.85mM和2.75mM，選擇指數(shù)(SI)分別等于17.8和18.4，在p1.3HBV瞬轉HepG2細胞中相應EC50值分別為1.82mM和1.62mM，SI為30和33.7;4）當聯(lián)合給藥時，二甲雙胍還能為現(xiàn)有兩類抗病毒藥拉米夫定和IFN-α2b提供降低HBsAg表達的補充作用和抑制病毒復制的協(xié)同作用。綜合考慮目前NUCs對降低HBsAg水平療效的明顯不足和我們觀察到的二甲雙胍的作用特點，我們認為，二甲雙胍作為直接的HBsAg生成抑制

13、劑或輔助抗HBV藥與NUCs聯(lián)合應用可能有助于提高臨床抗病毒治療的血清HBsAg陰轉率。
　　在第三部分工作中，我們從病毒和宿主兩個方面對二甲雙胍抑制HBsAg生成的可能機制進行了初步研究。采用Luciferaseassay測定HBV啟動子/增強子報告基因熒光素酶活性;Northernblot檢測胞內HBVRNAs表達;Westernblot檢測胞內AMPK和HNF4α表達。結果發(fā)現(xiàn):1）分別在HepG2細胞中瞬轉Sp1、Sp2、

14、ENⅡ/Cp、ENⅠ/Xp等4個HBV啟動子/增強子報告基因質粒后，二甲雙胍對熒光素酶活性表現(xiàn)出一致的明顯抑制作用;2）與報告基因熒光素酶活性的下降一致，二甲雙胍可明顯抑制HBV基因組(3.5kbpgRNA)和亞基因組(2.4/2.1kbsRNAs)的轉錄，可能與HBV復制方式的不同有關，這一效應在p1.3HBV瞬轉模型中更為明顯;3）在p1.3HBV瞬轉HepG2細胞模型中，以AMPK抑制劑小分子化合物CompoundC與二甲雙胍共同

15、進行干預，結果顯示CompoundC能明顯干擾二甲雙胍對HBV基因組和亞基因組的轉錄負調作用，但似乎不影響二甲雙胍對HBsAg生成的抑制效應;4）同樣在p1.3HBV瞬轉HepG2細胞模型中共轉pCMV-HNF4α以使核受體HNF4α過表達，可明顯干擾二甲雙胍對HBV基因組和亞基因組的轉錄負調作用以及二甲雙胍對HBsAg生成的抑制效應;5)二甲雙胍可抑制轉錄因子CRE、NFκβ啟動子報告基因的熒光素酶活性，并且對不含HBV調控序列(Sp

16、1、Sp2)的S基因攜帶質粒pCMV-SHBs瞬轉HepG2細胞的HBsAg表達僅有輕微的抑制趨勢。這些結果提示，二甲雙胍對HBsAg生成的抑制可能主要發(fā)生在轉錄水平，并且至少部分經(jīng)由肝細胞AMPK信號通路(AMPK活化進而下調HNF4α活性)介導的HBV基因組/亞基因組轉錄調控實現(xiàn)，但宿主-病毒間精確的轉錄調控機制需要進一步研究闡明。此外，CompoundC不夠特異的AMPK信號阻斷作用也需要我們聯(lián)合AMPK結構性表達腺病毒/靶向si