鴿Toll樣受體7基因的克隆及其免疫生物學功能研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是機體防御病原體入侵的首道防線。病原微生物感染后，機體細胞通過模式識別受體(Pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，然后激活下游信號通路，誘導炎性因子和Ⅰ型干擾素的表達。Toll樣受體7(Toll-like receptor7，TLR7)位于細胞的內體上，能識別病毒的單鏈RNA及咪唑

2、喹啉類成分，并誘導天然免疫應答，在抗病毒感染中具有重要作用。相較于哺乳動物TLR7，禽類TLR7的序列特征和生物功能還研究較少，目前主要集中在雞、鴨和鵝等水陸禽類中，而飛禽如鴿TLR7的研究至今還未見報道。本研究旨在克隆和分析鴿TLR7的基因序列，挖掘其關鍵的配體識別位點，并探索其在天然免疫應答中的功能，從而為進一步研究鴿TLR7的結構特征和生物功能以及禽類的天然免疫積累理論依據。
　　1.鴿TLR7基因的克隆、序列分析及其表達譜

3、檢測
　　本研究根據禽類TLR7基因的保守序列設計出特異性引物，首次從大王鴿克隆TLR7基因。利用生物信息學軟件分析其序列特征，鴿TLR7基因的開放閱讀框為3144 bp，編碼1047個氨基酸，結構預測表明其是一類典型的TLR，由N端的一個信號肽序列、15個LRR重復序列、一個LRR-CT和胞內TIR區(qū)組成。蛋白相互作用空間結構預測結果表明兩個TLR7的膜內結構域形成典型的“m”形二聚體。糖基化和磷酸化位點預測表明鴿TLR7含有1

4、8個潛在的N-糖基化位點和38個磷酸化位點。鴿TLR7氨基酸序列與人、鼠、雞、鴨TLR7的同源性分別為65.0％、62.2％、81.5％和83.8％。通過RT-PCR分析鴿不同組織中TLR7基因的表達差異，結果表明鴿TLR7在免疫相關組織尤其是脾臟和肝臟中具有較高的表達水平。
　　2.鴿TLR7的免疫生物學功能及其配體識別位點的挖掘
　　構建含有鴿TLR7的真核表達質粒pCMV-PiTLR7，轉染HEK293T細胞后，Wes

5、ternblotting鑒定了TLR7的表達。利用NF-κB熒光素酶報告載體，在R848配體刺激后，鴿TLR7能夠顯著地介導NF-κB的活化，表明鴿TLR7是一類有功能的TLR。對鴿TLR7 LRR序列進行分析后，發(fā)現(xiàn)LRR2、LRR11、LRR13和LRR14的第15位以及LRR10的第10位均存在氨基酸的插入修飾，于是我們通過overlap-PCR的方法分別構建了這些位點缺失的TLR7突變體，并連接到pCMV真核表達載體上。利用NF

6、-κB熒光素酶報告系統(tǒng)，結果顯示這些插入序列的缺失完全廢除了TLR7介導的NF-κB的活化，表明非經典LRR序列是TLR7發(fā)揮功能所必需的，這些序列可能是TLR7識別配體的關鍵位點。此外，通過qRT-PCR和ELISA方法檢測了TLR7和細胞因子的表達，結果表明TLR7突變體均不能介導IL-8的產生，這與NF-κB活性檢測實驗結果是一致的;然而部分突變體(Del10IN10和De114IN15)可介導IFN-α和TNF-α的產生，同時，

7、R848刺激后，鴿TLR7突變體的表達水平均有不同程度的上調，表明鴿TLR7突變體通過增加其表達量進而代償其功能的缺陷。然而，鴿TLR7 Del11IN15突變體盡管增加了其自身的表達量，仍不能有效地誘導IFN-α、IL-8和TNF-α的產生，表明關鍵LRR插入序列的缺失會導致假代償?shù)某霈F(xiàn)。
　　3.鴿TLR7介導激動劑及新城疫病毒感染的天然免疫應答研究
　　通過R848刺激鴿外周血單核細胞，應用熒光定量PCR的方法檢測TL

8、R7、IFN-γ、IL-6、IL-8、CCL5和IL-10的mRNA水平，結果表明R848刺激12h和24 h后前炎性細胞因子和相關抗病毒分子均顯著上調，而TLR7的表達水平沒有顯著變化。分別使用新城疫LaSota疫苗株和R848激動劑肌肉注射大王鴿，通過qRT-PCR的方法檢測了脾臟中TLR7及相關細胞因子的表達，結果表明R848肌肉注射組中TLR7的mRNA水平顯著升高，LaSota感染組TLR7的表達在第三天時顯著降低，而前炎性細