單精子顯微注射技術(shù)及胚胎發(fā)育的研究.pdf

1、目的：胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)是利用顯微操作儀將單個精子直接注入卵母細(xì)胞漿內(nèi)以建立妊娠的技術(shù)，一般適用于由于男性少、弱精或無精引起的不孕癥的治療，本研究在開展此項(xiàng)工作的同時，設(shè)計(jì)改造了胚胎操作箱，改進(jìn)了精子制動技術(shù)，提高了妊娠率。除此之外，為了降低體外授精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET)技術(shù)中多胎妊

2、娠的發(fā)生率，制訂了一系列的胚胎評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，提高了單胚妊娠率，減少了胚胎的移植數(shù)量(一般移植2個胚胎)，為今后生殖醫(yī)學(xué)的深入研究提供了臨床依據(jù)。 方法：選用臨床上診斷為重癥精子減少癥或無精癥(睪丸穿刺物中可找到精子)的不孕夫婦共88例，其中50例來自石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院生殖中心，38例來自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院生殖中心，。 卵子獲得：應(yīng)用常規(guī)IVF-ET超促排卵方案，適當(dāng)?shù)臅r間應(yīng)用抑制劑，并在抑制后的合適時間開始促排，

3、應(yīng)用促卵泡激素(FSH/LH)3～6支/天，至卵泡成熟時，肌肉注射HCG后36小時在B超引導(dǎo)下，經(jīng)陰道穿刺取卵。 所用試劑：HTF(人類輸卵管液)、HTF-HEPES(緩沖的人輸卵管液)、IVC-ONE(生長液-1)、OIL(油)、SSS(人工代血清)、ISOLATE(改良精子梯度液)、PVP(聚乙烯吡咯酮)、HY(透明質(zhì)酸酶)均為美國IrvineScientific(IS)公司生產(chǎn)。 卵的處理：在自制的胚胎操作箱(此箱

4、可恒溫、恒濕、固定CO2濃度)中進(jìn)行找卵、洗卵、拆蛋、觀察、移植、操作盤的制作等操作。應(yīng)用人工血清代用品(SSS)代替自體血清進(jìn)行試劑的配制：HTF+10％SSS：用于洗卵、裝卵、拆蛋；IVC-ONE+10％SSS：用于生長和移植； HTF-hepes+10％SSS：用于洗精和顯微注射；應(yīng)用Isolate代替Percoll用于梯度處理精液，以提高精子的回收率，對于精子數(shù)太少的進(jìn)行離心沉淀劃線法找精。 顯微注射：應(yīng)用OLY

5、MPUS公司顯微操作儀，將輕質(zhì)礦物油注入雙側(cè)管道中以排除氣泡，先上holding針，再上ICSI針，精子置于10％聚乙烯吡咯酮(polyvinypyrrolidone，PVP)溶液中制動后注入到成熟的卵母細(xì)胞漿內(nèi)，每次可以制動2～3個甚至4個精子一起吸入ICSI針中，分別注入每個卵母細(xì)胞中，這樣可以一次將一個液滴中的卵母細(xì)胞全部注射完成，節(jié)省時間，降低對卵的損傷。 胚胎移植：注射后14～18小時觀察受精情況，將受精卵和未受精卵分

6、開培養(yǎng)，同時記錄原核等級，微滴培養(yǎng)38～45小時觀察有無2～4細(xì)胞胚胎形成，應(yīng)用自制的胚胎評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對胚胎進(jìn)行評價(jià)后選取優(yōu)質(zhì)胚胎行胚胎移植術(shù)，≤35歲移植2個胚胎，＞35歲移植3個胚胎，在B超監(jiān)測下移植胚胎至宮腔。 妊娠標(biāo)準(zhǔn)：胚胎移植后11～14天檢測血中HCG濃度＞5.0U/L，移植6～7周用B超檢測宮內(nèi)有無胚囊、心博，見胚囊、心博為臨床妊娠。 結(jié)果：本研究在改裝的嬰兒保溫箱中進(jìn)行一系列卵的操作，在試劑應(yīng)用、操作手法和胚

7、胎評價(jià)上均進(jìn)行了改進(jìn)，大大提高了妊娠率，其中石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院組，患者年齡29～47歲，共50個周期，獲卵775個，平均得卵數(shù)15.5個/周期，其中成熟卵605個占78.1％，受精卵440個，受精率72.7％，發(fā)育成胚胎數(shù)為393個，占89.3％，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)318個，占80.9％，臨床妊娠24個，妊娠率48％，雙胎6例，三胎4例，多胎率41.7％。上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院組，患者年齡27～46歲，共38個周期，獲卵479個，平均得

8、卵數(shù)12.6個/周期，其中成熟卵362個占75.8％，受精卵272個，受精率75.1％，發(fā)育成胚胎數(shù)為233個，占85.7％，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)186個，占79.8％，臨床妊娠22個，妊娠率57.9％，雙胎4例，多胎率18.2％。 第一組在單精子顯微注射技術(shù)的應(yīng)用上我們與山東省立醫(yī)院[3]的數(shù)字相比較，受精率、妊娠率有明顯提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P＜0.01)，與廣州中山醫(yī)大第一附屬醫(yī)院[4]的數(shù)字相比較，受精率明顯提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有

9、顯著性差異(P＜0.01)，優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率有提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P＜0.05)。 胚胎評價(jià)改良組與未改良組指標(biāo)比較獲卵率和優(yōu)質(zhì)胚胎率雖無顯著性差異，但胚胎評價(jià)改良組臨床妊娠率有明顯提高，從48％提高到57.9％，多胎率下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1應(yīng)用改造的胚胎操作箱進(jìn)行卵的操作，應(yīng)用人工血清代用品代替自體血清，采用多精子同時制動，分別注射進(jìn)行單精子顯微注射等方法治療不孕癥，可以顯著提高ICSI