壽胎丸對(duì)HLa-G免疫信號(hào)通路的影響及機(jī)制初步非軍事化.pdf

1、目的：⑴探討壽胎丸不同藥物濃度、不同作用時(shí)間對(duì)HLA-G各亞型mRNA、蛋白表達(dá)的影響。⑵探討壽胎丸不同藥物濃度、不同作用時(shí)間對(duì)ILT2、KIR2DL4基因mRNA、蛋白表達(dá)的影響。⑶探討傳統(tǒng)方劑壽胎丸對(duì)母胎界面HLA G配體及其受體KIR2DL4、ILT2介導(dǎo)的信號(hào)通路的作用，及其在治療不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)中的作用。⑷探討HLA-G各亞型在不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)中的時(shí)序作用。
　　方法：①培養(yǎng)特異性表達(dá)HLA-G的JEG-3細(xì)胞，及表

2、達(dá)ILT2、KIR2DL4受體的NK92細(xì)胞。②取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的JEG-3細(xì)胞及NK92細(xì)胞，分別均勻接種于24孔板，每12小時(shí)取4個(gè)孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，至每孔細(xì)胞豐度達(dá)100％，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)目為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。③通過(guò)MTT細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)，確定含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基分別作用于JEG-3細(xì)胞、NK92細(xì)胞的有效作用濃度范圍，制定濃度梯度。④不同濃度梯度含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基作用于JEG-3細(xì)胞、NK92細(xì)胞，培養(yǎng)60小時(shí)，R

3、T-PCR檢測(cè)每12小時(shí)HLA-G各亞型、ILT2、KIR2DL4基因mRNA表達(dá)的情況。⑤不同濃度梯度含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基作用于JEG-3細(xì)胞、NK92細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每12小時(shí)膜型全長(zhǎng)HLA-G1、ILT2、KIR2DL4蛋白表達(dá)的情況。⑥取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的JEG-3細(xì)胞及NK92細(xì)胞，按不同數(shù)目比例進(jìn)行共培養(yǎng)24小時(shí)，MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定效靶比。⑦數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用重復(fù)測(cè)量方差分析，得到各基因整

4、體趨勢(shì)，及時(shí)間因素、濃度因素、交互效應(yīng)對(duì)各基因表達(dá)的貢獻(xiàn)大小。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)多重比較配對(duì)t檢驗(yàn)（Bonferroni法）進(jìn)行相同濃度各時(shí)間點(diǎn)上的兩兩比較;采用多因素方差分析進(jìn)行相同時(shí)間點(diǎn)上不同藥物濃度組間的兩兩比較。
　　結(jié)果：⑴寇式法計(jì)算含壽胎丸培養(yǎng)基進(jìn)行JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)的IC50濃度為1.884mg/ml， NK92細(xì)胞培養(yǎng)的IC50濃度為0.6088mg/ml。⑵不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G1 m

5、RNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=775.340，P=0.000）。3mg/ml對(duì)表達(dá)起抑制作用，2mg/ml及以下濃度于24h解除抑制后對(duì)HLA-G1 mRNA表達(dá)起促進(jìn)作用，以0.5mg/ml組最顯著。以36h為界點(diǎn)，36h前HLA-G1mRNA表達(dá)與濃度成正比;36h后HLA-G1mRNA表達(dá)與濃度呈反比。⑶不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G2 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=102.692，P=0.000）。0

6、.5mg/ml組與時(shí)間成正比，其他濃度組表達(dá)水平與時(shí)間因素間無(wú)依賴性，各濃度組表達(dá)最高點(diǎn)均位于60h時(shí)。低于3mg/ml藥物濃度于24h短暫抑制后隨時(shí)間對(duì)HLA-G2mRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用，以0.5mg/ml濃度最顯著。⑷不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G3 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=203.727，P=0.000）。各濃度組均在12h時(shí)表達(dá)水平最低，48h時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)低谷，60h時(shí)表達(dá)最高，表達(dá)水平與時(shí)間因素?zé)o依賴

7、關(guān)系。各時(shí)間點(diǎn)HLA-G3mRNA的表達(dá)均與濃度呈反比。60h表達(dá)以0.5mg/ml最高，且0.5mg/ml組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平始終位于對(duì)照組水平以上。⑸不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G4 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用(F=197.812，P=0.000)。除0.5mg/ml組與時(shí)間成正比外，其他濃度表達(dá)水平與時(shí)間因素間無(wú)依賴性，各濃度組60h時(shí)表達(dá)水平最高;0.5mg/ml組24h后表達(dá)水平均在同時(shí)間其他濃度組以上，且各時(shí)間

8、點(diǎn)表達(dá)均高于對(duì)照組。⑹不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G5 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用(F=472.895，P=0.000)。各濃度對(duì)HLA-G5mRNA表達(dá)24h后均為促進(jìn)作用，且與時(shí)間成正比。⑺不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G6 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=295.869，P=0.000）。2mg/ml、3mg/ml濃度對(duì)HLA-G6mRNA表達(dá)起促進(jìn)作用，60h時(shí)表達(dá)水平最高。1.5mg/ml、0.5

9、mg/ml濃度對(duì)HLA-G6mRNA表達(dá)起抑制作用。⑻不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)HLA-G7 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=468.075，P=0.000）。3mg/ml濃度組隨時(shí)間積累無(wú)明顯促進(jìn)作用，2mg/ml及以下濃度組隨時(shí)間起促進(jìn)作用。⑼不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)KIR2DL4 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=326.133，P=0.000）。各濃度組表達(dá)水平均與時(shí)間因素?zé)o依賴性，24h時(shí)表達(dá)最低，36h時(shí)

10、表達(dá)最高;12h、48h、60h各濃度組間無(wú)差異，24h、36h表達(dá)水平與濃度成反比，0.5mg/ml組各時(shí)間點(diǎn)均不低于其他濃度組及對(duì)照組。⑽不同時(shí)間、不同藥物濃度均對(duì)ILT2 mRNA的表達(dá)有影響，且存在交互作用（F=1487.783，P=0.000）。表達(dá)水平與時(shí)間因素?zé)o依賴性。48h、60h各濃度組表達(dá)水平相等，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平與濃度成反比。2mg/ml、1.5mg/ml濃度各時(shí)間點(diǎn)均不高于對(duì)照組，無(wú)顯著促進(jìn)作用;0.5mg/m

11、l濃度各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均不低于對(duì)照組，具有促進(jìn)作用。⑾不同時(shí)間對(duì)HLA-G1蛋白的表達(dá)有影響（F=53.102，P=0.000），不同濃度24小時(shí)內(nèi)對(duì)HLA-G1蛋白表達(dá)無(wú)影響（F=1.609，P=0.247）。各濃度表達(dá)水平與時(shí)間因素成反比，12h表達(dá)水平高于24h表達(dá)水平;12h時(shí)表達(dá)水平與濃度成正比，24h時(shí)表達(dá)水平與濃度成反比。24h內(nèi)藥物對(duì)HLA-G1蛋白表達(dá)無(wú)顯著促進(jìn)作用，0.5mg/ml以上濃度抑制作用明顯。⑿不同時(shí)間對(duì)ILT

12、2蛋白的表達(dá)有影響（F=23.946，P=0.001），不同濃度24小時(shí)內(nèi)對(duì)ILT2蛋白表達(dá)有影響（F=8.894，P=0.002），二者無(wú)交互作用(F=1.579，P=0.254)。各濃度表達(dá)水平與時(shí)間因素成正比，各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平均在對(duì)照組以上;各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平與濃度成反比，表達(dá)水平均在對(duì)照組以上。⒀壽胎丸在24小時(shí)內(nèi)對(duì)KIR2DL4蛋白在NK92細(xì)胞表面的低表達(dá)狀態(tài)無(wú)作用(P≥0.423)。⒁以NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，JEG-3細(xì)

13、胞為靶細(xì)胞，當(dāng)效靶比為10∶1時(shí)殺傷率高達(dá)60.40％，效靶比5∶1-1∶1抑制率在50％以下，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05），后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1∶1比例進(jìn)行。
　　結(jié)論：①壽胎丸可促進(jìn)HLA-G基因7種亞型的表達(dá)，且存在濃度效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)及相互效應(yīng)。②壽胎丸可促進(jìn)ILT2、KIR2DL4基因的表達(dá)，且存在濃度效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)及相互效應(yīng)。③壽胎丸可能通過(guò)上調(diào)HLA-G、KIR2DL4、ILT2基因表達(dá)，促進(jìn)NK細(xì)胞抑制性信號(hào)的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)