含Arg9的人源性抗HBsAg單鏈抗體-EGFP融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)及內(nèi)化活性的研究.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，純化，并對(duì)純化產(chǎn)物的親和活性和內(nèi)化作用進(jìn)行分析。 研究方法：設(shè)計(jì)引物將Arg9的編碼序列分別引入ScFv14基因的5'端、EGFP基因的5'端和3'端，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將測(cè)序正確的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分別與R9/EGFP、EGFP/R9和EGFP基因連接后克隆入原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(D

2、E3)LysS原核誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni-NTA柱進(jìn)行純化后，用間接ELISA方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物與HBsAg的親和活性，并用間接免疫熒光檢測(cè)純化蛋白的內(nèi)化活性。 研究結(jié)果：經(jīng)測(cè)序表明，擴(kuò)增的目的基因序列正確，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)成功構(gòu)建了帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)LysS后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE證實(shí)四種融合蛋白被成功表達(dá)，表達(dá)量分別占菌體總蛋白的25％、20％、

3、30％和25％。間接ELISA檢測(cè)證實(shí)四種融合蛋白均具有HBsAg結(jié)合活性，用Ni-NTA柱純化后，間接免疫熒光檢測(cè)顯示Arg9位于N端的融合蛋白有較強(qiáng)的內(nèi)化作用，而且能特異性的內(nèi)化進(jìn)入HbsAg陽(yáng)性的HepG2.2.15細(xì)胞。 研究結(jié)論：成功構(gòu)建、表達(dá)和純化了SeFv14/EGFP融合蛋白和三種帶有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白，純化產(chǎn)物均具有與抗原HbsAg結(jié)合的活性，N端帶有Arg9的融合蛋白對(duì)靶細(xì)胞有較強(qiáng)的內(nèi)化