肝癌細(xì)胞系HepG2特異性結(jié)合短肽的篩選及其特異性研究.pdf

1、肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程非常復(fù)雜，涉及到肝癌細(xì)胞多分子的調(diào)變，利用不同的新技術(shù)和新方法或者將其排列組合，對(duì)肝癌細(xì)胞或肝癌組織進(jìn)行鑒定篩選，在肝癌診療研究中具有重要的意義。表面展示技術(shù)(surface display)在篩選新配體方面顯示了潛在的應(yīng)用價(jià)值。本課題應(yīng)用FliTrxTM細(xì)菌表面展示的隨機(jī)十二肽庫(kù)(FliTrxTM random peptide library)，通過活細(xì)胞篩選獲得能與人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HepG2特異性結(jié)合的多肽，為

2、肝癌的靶向診斷和靶向治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 從FliTrxTM細(xì)菌表面展示的隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選與人肝癌細(xì)胞系HepG2特異性結(jié)合的十二肽，鑒定其結(jié)合特性，利用生物信息學(xué)工具分析其結(jié)構(gòu)，為尋找肝癌細(xì)胞表面特異性標(biāo)志以及肝癌的靶向診斷與靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．肽庫(kù)的篩選以正常肝細(xì)胞系L02為減差篩選的對(duì)照細(xì)胞，肝癌細(xì)胞系HepG2為篩選的靶細(xì)胞，從FliTrxTM細(xì)

3、菌表面展示的隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選與HepG2特異性結(jié)合的短肽。經(jīng)過五輪減差篩選，從最后一輪洗脫重收獲的細(xì)菌中隨機(jī)挑選700個(gè)單克隆細(xì)菌，通過菌落PCR篩選其中含有完整融合基因的克隆。
　　 2．短肽的特異性鑒定與序列分析以L02細(xì)胞為對(duì)照，通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)單克隆和 HepG2的結(jié)合特異性；陽性克隆的測(cè)序結(jié)果與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。進(jìn)一步采用FCM鑒定單克隆十二肽與不同惡性腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合特性，包括胃癌細(xì)胞系M

4、KN28、乳腺癌細(xì)胞系MCF7、宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Hela、早幼粒急性白血病細(xì)胞系HL60、慢性骨髓性白血病細(xì)胞系K562、肺鱗狀上皮細(xì)胞癌SLC等。
　　 3．結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　 利用Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的ProtParam工具，初步分析特異性多肽的氨基酸序列及穩(wěn)定性；利用EMBL蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的AGADIR工具，預(yù)測(cè)其可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的3Djigsaw蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器模建短肽

5、-TrxA融合蛋白的空間構(gòu)象。
　　 4．結(jié)合的靶分子分析利用SDS-PAGE優(yōu)化誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)多肽的條件，進(jìn)一步在Western-Blot中用可溶性短肽-TrxA融合蛋白檢測(cè)多肽與肝癌細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合，以L02和SLC細(xì)胞為對(duì)照，分析多肽特異性識(shí)別的肝癌細(xì)胞表面分子。
　　 結(jié)果：
　　 1．肽庫(kù)的篩選以正常肝細(xì)胞系L02和肝癌細(xì)胞系HepG2為篩選靶細(xì)胞，對(duì)FliTrxTM細(xì)菌肽庫(kù)進(jìn)行五輪差異篩選，從最后一輪篩

6、選得到的多克隆中隨機(jī)挑選700個(gè)陽性單克隆，菌落PCR結(jié)果表明，其中200個(gè)克隆含有完整的融合蛋白基因。
　　 2．短肽與肝癌細(xì)胞系結(jié)合的特異性FCM證實(shí)200個(gè)克隆中10個(gè)克隆表達(dá)的短肽可與肝癌細(xì)胞系HepG2相對(duì)特異性結(jié)合；經(jīng)DNA測(cè)序，基因序列分析，確定7個(gè)陽性克隆，分別插入不同序列的隨機(jī)肽片段。7個(gè)短肽的基因序列中存在出現(xiàn)頻率較高的位點(diǎn)，但與Pubmed，Swissprot和EMBL的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，并未

7、發(fā)現(xiàn)具有高度同源性的序列。
　　 FCM檢測(cè)7個(gè)短肽與不同惡性腫瘤細(xì)胞系(包括胃癌、乳腺癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌、早幼粒急性白血病細(xì)胞系、慢性骨髓性白血病細(xì)胞系、肺鱗狀上皮細(xì)胞癌)結(jié)合的特性，發(fā)現(xiàn)其中三個(gè)短肽只顯示出與肝癌細(xì)胞系相對(duì)較高的結(jié)合能力，命名為Hep1，Hep2和Hep3。
　　 3．結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)結(jié)果利用ProtParam工具分析發(fā)現(xiàn)，Hep1和Hep2的結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定，而Hep3具有相對(duì)穩(wěn)定的線性結(jié)構(gòu)。AGADIR

8、工具對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)提示，Hep1和Hep2可能形成α螺旋，而Hep3不會(huì)形成α螺旋。3Djigsaw同源模建得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)提示短肽-TrxA融合蛋白中的短肽均形成突出于融合蛋白之外的空間構(gòu)象，提示由TrxA形成的隨機(jī)肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在與靶分子的識(shí)別中起到了重要的作用。
　　 4．十二肽結(jié)合的靶分子利用可溶性Hep1，Hep2和Hep3與TrxA的融合蛋白檢測(cè)肝癌細(xì)胞，以SLC和L02細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，隨機(jī)挑取的無關(guān)單克隆短肽-Tr

9、xA融合蛋白作為對(duì)照檢測(cè)分子，Western-Blot結(jié)果顯示Hep1，Hep2和Hep3三種不同的短肽-TrxA融合蛋白均可以識(shí)別HepG2細(xì)胞膜蛋白中大小約為140kDa的分子片段，而與SLC和L02反應(yīng)未見特異性條帶。隨機(jī)可溶性短肽-TrxA融合蛋白與肝癌細(xì)胞、SLC和L02細(xì)胞反應(yīng)均為陰性。
　　 結(jié)論：以人肝細(xì)胞系L02為對(duì)照，人肝癌細(xì)胞系HepG2為靶細(xì)胞，通過五輪減差篩選，從細(xì)菌鞭毛展示的隨機(jī)肽庫(kù)中獲得與HepG2