體外三維培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化生長因子β1基因轉(zhuǎn)染的兔骨髓間充質(zhì)干細胞促成軟骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1.采用全骨髓漂洗法獲取兔骨髓并結(jié)合密度梯度離心法從骨髓血中分離出BMSCs加以純化，進行體外單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)。研究在體外三維培養(yǎng)條件下，兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)傳代增殖的生物學特性，建立較為成熟和穩(wěn)定的BMSCs體外三維培養(yǎng)體系。 2.選擇腺病毒載體作為基因轉(zhuǎn)染的載體以提高對外源性DNA的轉(zhuǎn)染率和表達效率。通過對TGF-β1基因重組腺病毒載體Ad.TGF-β1構(gòu)建的研究，希望建立一套腺病毒載體構(gòu)建、包

2、裝、擴增、純化及治療的方法，并對腺病毒載體的性質(zhì)及生物學活性有初步研究，為今后利用腺病毒載體打下基礎(chǔ)。 3.通過研究Ad.TGF-β1基因體外轉(zhuǎn)染BMSCs后BMSCs分別在單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的不同培養(yǎng)條件下TGF-β1體外表達情況及特異性的軟骨細胞外基質(zhì)分泌情況；探討基因轉(zhuǎn)染及三維培養(yǎng)體系對誘導BMSCs向軟骨細胞定向分化的影響，為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷及構(gòu)建組織工程化軟骨提供一個基礎(chǔ)性研究和理論依據(jù)。 方法：

3、1.通過采用全骨髓漂洗法獲取兔長骨腔骨髓血并結(jié)合密度梯度離心法從骨髓血中分離出BMSCs加以純化，進行體外單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)。研究兩種培養(yǎng)條件下BMSCs傳代、增殖的生物學特性。 取四周齡新西蘭兔，以氯胺酮麻醉后取雙側(cè)全長股骨及肱骨，在超凈臺內(nèi)無菌條件下用全骨髓漂洗法獲得兔長骨腔骨髓血并結(jié)合密度梯度離心法從骨髓血中分離出BMSCs并加以純化、鑒定后進行原代培養(yǎng)，并進一步行單層傳代培養(yǎng)及三維培養(yǎng)擴增，研究兩種培養(yǎng)條件下BMSCs傳

4、代、增殖的生物學特性。 2.TGF-β1基因重組腺病毒粘粒載體(pAdEasy1.TGF-β1)的構(gòu)建。抽提脾臟組織mRNA，經(jīng)RT-PCR合成TGF-β1基因，繼而再將其插入帶有腺病毒基因組的粘粒載體pAdEasy1，擴增后挑選插入方向正確的克隆。 3.TGF-β1基因重組腺病毒載體Ad.TGF-β1的構(gòu)建。 應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染lipofection及DNA-TPC制備重組腺病毒，將酶切鑒定為正確的病毒克隆進一步擴

5、增、純化和測定滴度。同時對其使用的安全性進行評價。 4.將Ad.TGF-β1基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞及促成軟骨細胞分化的研究 首先，Ad.TGF-β1基因體外轉(zhuǎn)染BMSCs；將轉(zhuǎn)染后BMSCs分別進行單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)，并用TGF-β1免疫熒光抗體技術(shù)、RT-PCR、Western-blot法檢測轉(zhuǎn)染后不同條件下TGF-β1體外表達情況。其次，用改進的二甲基亞甲藍(DMB)比色法測定特異性細胞外基質(zhì)的糖胺多糖含量、Ⅱ膠

6、原免疫組化、Western-blot法檢測轉(zhuǎn)染后在單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的不同培養(yǎng)條件下特異性軟骨細胞外基質(zhì)Ⅱ膠原分泌情況，研究Ad.TGF-β1轉(zhuǎn)染BMSCs后促成軟骨細胞分化的能力。 結(jié)果： 1.我們采用全骨髓漂洗法獲取兔長骨腔骨髓血并結(jié)合密度梯度離心法從骨髓血中分離出BMSCs加以純化，并成功進行體外單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)。BMSCs在三維培養(yǎng)條件下細胞分裂增殖更活躍，成團族狀，傳代數(shù)更多，維持時間更久。6-8周后才出現(xiàn)細

7、胞老化衰退。細胞計數(shù)水平及細胞集落明顯高于體外單層傳代培養(yǎng)，從而構(gòu)建了較為穩(wěn)定的BMSCs體外三維培養(yǎng)體系。這為軟骨組織工程獲得大規(guī)模的種子細胞提供了一種可能。 2.提取的RNA完整、純度高，RT-PCR合成的DNA片段經(jīng)克隆、測序后確證為目的基因——TGF-β1基因，插入粘粒載體pAdEasy1后篩選插入方向正確的克隆用于擴增。 3.建立了穩(wěn)定、有效的TGF-β1基因重組腺病毒載體Ad.TGF-β1構(gòu)建方法，擴增純化后

8、重組腺病毒滴度高達1012pfu/ml，體外使用安全。 4.我們用重組腺病毒Ad.TGF-β1能安全、高效的成功轉(zhuǎn)染BMSCs，并通過免疫熒光抗體技術(shù)、免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)的BMSCs有大量TGF-β1表達，一直持續(xù)到6-8周以后。 5.結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TGF-β1后BMSCs能持久地分泌顯著增加的特異性軟骨細胞外基質(zhì)成分CollagenⅡ、蛋白多糖等。同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)組較單層培養(yǎng)組糖胺多糖、Collag

9、enⅡ的分泌量多、維持時間長。這表明轉(zhuǎn)染后BMSCs體外能成軟骨細胞分化，并且轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)組優(yōu)于單層培養(yǎng)組。 結(jié)論： 1.采用全骨髓漂洗法獲取兔長骨腔骨髓血并結(jié)合密度梯度離心法從中分離出BMSCs加以純化，并成功進行體外單層培養(yǎng)及三維培養(yǎng)。成功的構(gòu)建了藻酸鈉凝膠三維培養(yǎng)體系，BMSCs在三維培養(yǎng)條件下細胞分裂增殖更活躍，成團族狀，傳代數(shù)更多，維持時間更久。6-8周后才出現(xiàn)細胞老化衰退。更重要的是三維培養(yǎng)體系與體內(nèi)微環(huán)境

10、更相似，為研究骨髓BMSCs在動物體內(nèi)培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。 2.DNA末端蛋白復合物可使重組腺病毒的制備效率大大提高，降低野生型腺病毒出現(xiàn)的概率。重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低。 3.我們構(gòu)建的攜帶TGF-β1基因的腺病毒載體，能高效、安全的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BMSCs。BMSCs能夠較持久表達、分泌TGF-β1。轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)的BMSCs能夠較持久表達、分泌TGF-β1，一直持續(xù)到6周以后。 4.經(jīng)轉(zhuǎn)染Ad.TGF-β1后