抗單、雙相抑郁癥藥對原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　氟西汀作為SSRIs代表藥是目前治療抑郁癥的常用藥之一，有較好的療效。最近研究表明氟西汀能通過對谷氨酸受體結(jié)構(gòu)和功能的改變來改善焦慮和習(xí)得性無助的動物模型的抑郁癥狀。可溶性鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平是目前治療雙相抑郁癥的常用藥，三種藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)均無相似之處，臨床上在雙相抑郁癥的躁狂期能引起較好的療效，但是這些藥物發(fā)揮療效的確切藥理機(jī)制目前尚未闡明，研究藥物潛在的共同作用機(jī)制是探尋新的藥物治療策略的有效途徑。我們實驗室之前

2、的研究證明三種藥物長期作用通過下調(diào)TRPC1表達(dá)抑制高鉀引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高，提示三種藥物可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i影響谷氨酸釋放。本課題采用原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察氟西汀、鋰鹽、丙戊酸鈉和卡馬西平長期作用對細(xì)胞外ATP和高K+刺激誘發(fā)的谷氨酸釋放的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為抗單、雙相抑郁癥的藥物治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　取新生小鼠大腦皮質(zhì)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，加入雙丁酰環(huán)腺苷酸

3、（Dibutaryl cyclic AMP，dBcAMP）作用1周促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。分別加入氟西?。?0μM）作用1、2、3周和丙戊酸鈉(0.1 mM、1mM)、卡馬西平（25μM和50μM）、碳酸鋰（Li+濃度0.25 mM、0.5 mM和1 mM）作用2周，進(jìn)行如下實驗:①用HPLC法檢測細(xì)胞外200μM ATP和45mMK+刺激引起的谷氨酸釋放量，和細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量;②細(xì)胞用熒光探針染料Fura-2負(fù)載，奧林巴斯活細(xì)胞熒光顯微鏡下

4、檢測氟西汀作用不同時間對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。
　　實驗結(jié)果采用使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組資料用one-wayANOVA方法進(jìn)行比較，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞外高K+刺激是通過增加星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i使細(xì)胞谷氨酸釋放增多。
　　熒光探針技術(shù)檢測[Ca2+]i，結(jié)果顯示細(xì)胞應(yīng)用45 mM K+刺激能持久引起[Ca2+]i的增加，應(yīng)用L-型電壓依賴鈣通

5、道抑制劑Nifedipine均可抑制45 mM K+引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加。HPLC法檢測結(jié)果顯示無鈣緩沖液對45 mM K+引起星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞谷氨酸釋放增多起到明顯抑制作用。Nifedipine和鈣庫RyR抑制劑Ryanodine能顯著降低45 mM K+引起星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放增多，而應(yīng)用RyR激動劑4-CMC能明顯放大45 mM K+的作用。提示細(xì)胞外高K+刺激能通過增加Ca2+內(nèi)流和鈣庫釋放，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2

6、+]i，從而使細(xì)胞谷氨酸釋放增多。
　　2、細(xì)胞外ATP刺激通過增加星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i使細(xì)胞谷氨酸釋放增多。
　　HPLC法檢測結(jié)果顯示P2Y受體阻滯劑、無鈣緩沖液、RyR抑制劑和SOCC抑制劑均能明顯降低細(xì)胞外ATP引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放增多，而RyR激動劑強(qiáng)化了ATP引起的谷氨酸釋放。提示細(xì)胞外ATP通過激活細(xì)胞膜上相應(yīng)受體引起星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高，從而使谷氨酸釋放增多。
　　3、三種抗雙相

7、抑郁癥藥物作用2周對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的抑制作用
　　成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用VPA（0.1mM和1mM）、CBZ（25μM和50μM）和Li+（0.25 mM、0.5 mM和1 mM）作用2周對谷氨酸基礎(chǔ)釋放量沒有影響，但不同濃度的三種藥物均可明顯抑制200μM ATP和45 mM K+引起的谷氨酸釋放量的增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異。三種藥物對星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸含量沒有影響。
　　4、三種抗雙相抑郁癥藥物對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸

8、釋放調(diào)節(jié)具有藥物特異性
　　與VPA和CBZ一樣，托吡酯也為抗癲癇藥物，臨床上也可用于治療雙相抑郁癥。本實驗結(jié)果100μM托吡酯作用2周增加了星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的基礎(chǔ)釋放量，在ATP刺激下也能引起谷氨酸釋放增多，且細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的含量也明顯增多，說明托吡酯對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的作用無意義。結(jié)果表明三種抗雙相抑郁癥藥物長期作用對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放具有藥物特異性。
　　5、抗抑郁藥氟西汀作用不同時間對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放

9、的影響
　　成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用氟西?。?0μM）作用1、2和3周對谷氨酸基礎(chǔ)釋放量沒有影響，但不同作用時間氟西汀對細(xì)胞谷氨酸釋放量有所不同，表現(xiàn)為藥物作用1周后可增加45 mM K+刺激液引起的谷氨酸釋放量;應(yīng)用氟西汀作用2周后可部分抑制45 mM K+刺激液引起的谷氨酸釋放量增多，在給予高鉀刺激液的第1、2 min現(xiàn)象明顯;應(yīng)用氟西汀作用3周，能明顯抑制45 mM K+刺激液引起的谷氨酸釋放量增多，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異

10、。
　　討論：
　　谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸介導(dǎo)大腦絕大多數(shù)的快興奮傳遞，病理狀態(tài)下谷氨酸的過量釋放所產(chǎn)生的興奮性毒性是多種精神情感障礙疾病以及神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。有文獻(xiàn)報道星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙可引起谷氨酸代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致情感障礙疾病的發(fā)生，推測抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放可能成為治療情感障礙藥物的潛在靶點之一。
　　目前的研究表明病理狀態(tài)下Ca2+依賴的谷氨酸釋放是其主要機(jī)制，

11、星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高能夠促進(jìn)谷氨酸的釋放。本實驗結(jié)果無鈣緩沖液能明顯降低ATP和高鉀誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放增多，表明ATP和高鉀誘導(dǎo)的谷氨酸釋放與Ca2+關(guān)系密切。L-型電壓依賴鈣通道阻斷劑Nefidipine能抑制高鉀引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放增多也表明電壓依賴性Ca2+通道引起的Ca2+內(nèi)流參與谷氨酸釋放過程。應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)鈣庫RYR拮抗劑ryanodine也能使ATP和高鉀誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放增多減少。因此高K

12、+可通過激活電壓依賴性Ca2+通道和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲池釋放兩種方式增加星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]進(jìn)而引起Ca2+依賴的谷氨酸釋放。同樣ATP引起的谷氨酸釋放增多也與細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲池釋放有關(guān)。本實驗應(yīng)用含SOCC抑制劑SKF-96365緩沖液作用星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測谷氨酸釋放量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞谷氨酸釋放不僅對ATP刺激不敏感，而且基礎(chǔ)的谷氨酸分泌量也減少，說明細(xì)胞膜SOCC的開放引起鈣庫再充對星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸釋放起主要作用。
　　抗

13、雙相情感障礙藥丙戊酸鈉、卡馬西平和碳酸鋰持續(xù)作用2周能抑制ATP和高鉀引起的原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放，結(jié)合本實驗室之前研究，三種藥物作用2周，使45 mMK+刺激細(xì)胞內(nèi)鈣增加幅度降低，且很快恢復(fù)正常，這說明調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放可能是三種藥物的主要作用環(huán)節(jié)。同時，三種抗雙相抑郁癥藥物均能明顯下調(diào)細(xì)胞TRPC1 mRNA的表達(dá)，TRPC1是星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)SOCC的主要組成蛋白通，TRPC1表達(dá)下調(diào)抑制鈣庫的再充功能，直接降低由R

14、yR和IP3R介導(dǎo)的[Ca2+]i升高。提示三種藥物的長期作用能通過下調(diào)TRPC1表達(dá)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+依賴的谷氨酸釋放。而與卡馬西平和丙戊酸鈉同為抗癲癇藥物的托吡酯給藥2周不能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放，表明三種抗雙相抑郁癥藥物長期作用對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放具有藥物特異性。
　　抗抑郁藥氟西汀能夠活化L-型電壓依賴鈣通道Cav1.2亞型引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，而長期作用后能抑制SOCC主要蛋白TRPC1表達(dá)，降低細(xì)胞

15、內(nèi)Ca2+濃度。氟西汀的這兩種作用可能是實驗中觀察到的氟西汀給藥時間不同對星形膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i和谷氨酸釋放雙重作用的機(jī)制。
　　本研究結(jié)果從離體水平上為抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放在抗單、雙相抑郁癥治療中的作用提供了一定的理論依據(jù)，但星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸在突觸前神經(jīng)元、突觸后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行興奮性傳遞是一種復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用MRI技術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)谷氨酸——谷氨酰胺在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞代謝循環(huán)中是一種動態(tài)調(diào)節(jié)過程，因此情

16、感障礙患者谷氨酸調(diào)節(jié)功能機(jī)制的失常遠(yuǎn)比觀察到的遞質(zhì)改變復(fù)雜，因此探明谷氨酸系統(tǒng)在單、雙相抑郁癥發(fā)病中的作用從而開發(fā)出更有效的治療藥物還需大量的深入研究。
　　結(jié)論:
　　1、三種抗雙相精神障礙藥物L(fēng)i2CO3、VPA和CBZ長期作用均能抑制ATP和高鉀引起的星形膠質(zhì)谷氨酸釋放增加，且具有藥物特異性。
　　2、抗抑郁癥藥物氟西汀對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放作用與藥物作用時間相關(guān)，氟西汀長期作用能抑制高鉀引起的星形膠質(zhì)谷氨酸釋