抗乳腺癌人源單鏈抗體CM1-scFv的表達(dá)與活性分析.pdf

1、乳腺癌是婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，外科手術(shù)、放射與藥物治療均為乳腺癌的重要治療手段。藥物療法是乳腺癌綜合治療的重要組成部分。單克隆抗體有高度特異性，探索乳腺癌的抗體靶向治療有重要的臨床價(jià)值。由于人體對(duì)鼠源單克隆抗體能產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，人源單克隆抗體成為單克隆抗體應(yīng)用于臨床治療的一個(gè)關(guān)鍵因素。 1991年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王樹蕙教授利用轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞與人鼠雜合骨髓瘤SMH-D33融合

2、，篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗乳腺癌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，CM1。據(jù)報(bào)道該抗體重鏈類型為人μ鏈，輕鏈類型為鼠κ鏈。免疫組化、裸鼠移植瘤放射免疫顯像顯示其有較強(qiáng)特異性。與平陽(yáng)霉素構(gòu)建的化學(xué)偶聯(lián)物有高于游離平陽(yáng)霉素的抑瘤率，表明CM1單克隆抗體有可能發(fā)展成為抗腫瘤藥物的載體將藥物導(dǎo)向腫瘤組織。 力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是本研究室從一株放線菌(Streptomycesglobisporussp.C-1027)代謝產(chǎn)物中獲得

3、的對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。力達(dá)霉素的分子由發(fā)色團(tuán)和輔基蛋白組成，發(fā)色團(tuán)具有細(xì)胞殺傷活性，輔基蛋白起保護(hù)穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)的作用，二者可拆分與重建。重建的力達(dá)霉素與天然狀態(tài)力達(dá)霉素具有相同高度的活性。 本研究鑒定了抗體輕鏈來源，分別構(gòu)建了CM1單鏈抗體和單鏈抗體力達(dá)蛋白融合蛋白的原核表達(dá)載體，pET-scFv，pET-scFv-LDP。pET-scFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21starTM(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)

4、，純化，復(fù)性得到純化的scFv，研究其免疫活性，探討進(jìn)一步開發(fā)融合蛋白的價(jià)值。 一、抗乳腺癌人源單鏈抗體CM1-scFv的表達(dá)、純化及活性分析采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞株CM1進(jìn)行亞克隆化培養(yǎng)，取上清經(jīng)間接ELISA檢測(cè)出抗體高分泌亞克隆4A7和4A8。擴(kuò)大培養(yǎng)4A7和4A8，收集上清經(jīng)硫酸胺沉淀濃縮后進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散分析，證明CM1單克隆抗體的輕鏈來源于小鼠，含人輕鏈基因的染色體已經(jīng)丟失，從雜交瘤中克隆出人源化輕鏈基因的可能性小

5、。于是從已有的含有該單克隆抗體重鏈輕鏈可變區(qū)的質(zhì)粒出發(fā)構(gòu)建含組氨酸標(biāo)簽肽(Histag)的單鏈抗體。 經(jīng)SOE-PCR克隆出VH-Linker-VL形式的單鏈抗體基因，Linker由3個(gè)GGGGS串聯(lián)組成。將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。取序列準(zhǔn)確無誤的克隆進(jìn)行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，釋放出的片段與同樣雙酶切過的pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。篩選出的重組克隆經(jīng)測(cè)序證明無誤后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.

6、coliBL21star(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE分析證明有約27kDa外源蛋白的表達(dá)，Western-blot結(jié)果證實(shí)在27kDa的誘導(dǎo)表達(dá)條帶是帶有Histag標(biāo)簽肽序列的重組單鏈抗體。 定位分析表明蛋白以不可溶包涵體形式存在于細(xì)胞質(zhì)。經(jīng)SDS-PAGE分析，1L菌液誘導(dǎo)后能產(chǎn)生約200mg含重組單鏈抗體的包涵體。用含6M尿素的變性液溶解包涵體，利用基于固定化Ni離子親和層析柱，對(duì)單鏈抗體CM1-

7、scFv進(jìn)行了純化得到約6mg可溶性變性產(chǎn)物。采用分步透析的方法對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性過程中出現(xiàn)了白色絮狀蛋白沉淀，超濾濃縮上清后得到濃度280μg/ml的可溶蛋白3ml。 間接ELISA法測(cè)定單鏈抗體CM1-scFv與CAMA細(xì)胞的親和力常數(shù)為2.5×10-6M。ELISA法測(cè)定CM1-scFv與人胰腺癌PANC1細(xì)胞，人肝癌Bel-7402細(xì)胞人結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)表明單鏈抗體與Bel-7402有較高的結(jié)合活性，與

8、其他腫瘤細(xì)胞結(jié)合活性低。Western-blot結(jié)果表明CAMA細(xì)胞HER-2表達(dá)水平不高，與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞表達(dá)水平相似。采用ELISA法測(cè)定CM1-scFv與三種人乳腺癌細(xì)胞系的免疫反應(yīng)性。結(jié)果顯示，單鏈抗體并沒有對(duì)HER-2表達(dá)量高的SKBr-3細(xì)胞顯示出高于MCF-7，CAMA細(xì)胞的結(jié)合活性，說明CM1單克隆抗體靶抗原是HER-2的可能性不大。 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析CM1-scFv的優(yōu)點(diǎn)是含有一條人源的重鏈可變區(qū)，不足之

9、處是復(fù)性難度大，容易形成沉淀降低了活性純化蛋白的產(chǎn)量。免疫活性分析結(jié)果不提示CM1-scFv有很高的親和力，這個(gè)可能與蛋白復(fù)性不理想有關(guān)。 二、抗乳腺癌人源單鏈抗體力達(dá)蛋白CM1-scFv-LDP融合基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 CM1-scFv復(fù)性困難可能與分子間疏水鍵相互作用形成多分子復(fù)合物有關(guān)，于是考慮將其以融合蛋白形式表達(dá)，利用LDP的空間位阻保護(hù)重鏈輕鏈可變區(qū)的疏水鍵，抑制分子間相互作用。一方面有可能提高蛋白復(fù)性

10、效率，另一方面與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)分子重建，使融合蛋白在有靶向性的同時(shí)還具有細(xì)胞毒性。 從第一部分構(gòu)建的含有CM1-scFv基因的pT-scFv和含有LDP基因的pET-VHLDP出發(fā)，PCR克隆出添加了Spacer肽，具有序列重疊區(qū)的CM1-scFv、LDP基因，通過重組PCR成功構(gòu)建融合基因scFv-Spacer-LDP。PCR產(chǎn)物插入pGEM-T載體，測(cè)序結(jié)果無誤。進(jìn)行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，釋放出的片段與同樣雙酶切過的pE

11、T-30a(+)連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取重組克隆得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-scFv-LDP。測(cè)序結(jié)果顯示融合蛋白的基因序列，在T7lac啟動(dòng)子的控制下，6個(gè)連續(xù)的組氨酸插入到融合蛋白的C-末端，緊鄰終止密碼子。CM1-scFv-LDP融合基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建為進(jìn)一步表達(dá)融合蛋白奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，CM1單克隆抗體的人源特性使其具備了發(fā)展成為治療性抗體的潛力。本研究證明CM1單克隆抗體的重鏈為人源性，輕鏈為鼠源