巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)基因沉默改善糖尿病ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用研究.pdf

1、第一部分STZ誘導(dǎo)糖尿病聯(lián)合正常飲食促ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用研究
　　研究背景及目的:
　　由于ApoE-/-小鼠缺乏清除極低密度脂蛋白膽固醇(Very Low Density LipoproteinCholesterol，VLDL-C)和由乳糜顆粒產(chǎn)生的殘粒脂蛋白的能力，因此較易出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣斑塊。實(shí)驗(yàn)表明非高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS斑塊病變出現(xiàn)晚、病變輕，隨周齡增加病變加重;而高脂飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠

2、早期即出現(xiàn)明顯AS斑塊。因此高脂飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型已廣泛用于AS疾病的基礎(chǔ)研究。然而目前用于糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化(Athero sclerosis，AS)疾病研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型仍相對(duì)匱乏，已有的Glut4-/-小鼠、MKR轉(zhuǎn)基因小鼠、Fatless-A-ZIP/F1小鼠等都無(wú)法滿足當(dāng)前科研需要。近年來(lái)，糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)研究廣泛采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)物模型。美國(guó)糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型協(xié)會(huì)(Animal Mo

3、delsof Diabetic Complications Consortium，AMDCC)和大量實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了該模型的可行性。既往研究者多采用高脂飲食喂養(yǎng)此模型，極少采用正常飲食。主要因?yàn)楦咧桂B(yǎng)可顯著增加小鼠總膽固醇(Total Cholesterol，TC)水平。事實(shí)上，臨床合并動(dòng)脈粥樣硬化的糖尿病患者血脂TC水平增加并不顯著。而且高血糖和高膽固醇雙重復(fù)雜因素的刺激不利于糖尿病AS疾病機(jī)制和干預(yù)的研究。因此高脂飲食聯(lián)合鏈脲菌素

4、(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病ApoE-/-小鼠模型不能反映臨床合并動(dòng)脈粥樣硬化的糖尿病患者真實(shí)狀態(tài)?；谏鲜鲈颍覀償M采用STZ誘導(dǎo)糖尿病聯(lián)合非高脂飲食觀察ApoE-/-小鼠AS斑塊病變特點(diǎn)，為糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化疾病的基礎(chǔ)研究提供理想和可靠的動(dòng)物模型。
　　研究方法:
　　1.建立ApoE-/-小鼠糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型ApoE-/-小鼠，雄性，8周齡，22±2g，75只，購(gòu)于北京大學(xué)。獲取Apo

5、E-/-小鼠尾巴組織提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定其基因型。所有小鼠飼養(yǎng)于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管重構(gòu)與功能研究實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。普脂喂養(yǎng)，不限水限食，共喂養(yǎng)15周后進(jìn)行安樂死。所有小鼠適應(yīng)性普脂喂養(yǎng)兩周后開始干預(yù)。連續(xù)五天腹腔注射檸檬酸鹽溶解的STZ。利用STZ毒性作用破壞小鼠β胰島細(xì)胞進(jìn)而升高血糖。僅注射檸檬酸鹽緩沖液的ApoE-/-小鼠(n=36)設(shè)為非糖尿病對(duì)照組。尾靜脈取血檢測(cè)血糖。連續(xù)4周血糖高于15mmol/L者入組糖尿病

6、組(n=37)。繼續(xù)喂養(yǎng)8周后行安樂死。
　　2.體重、血糖和血生化指標(biāo)檢測(cè)分別于STZ注射前和安樂死前檢測(cè)每組小鼠體重、血糖和血清總膽固醇(TotalCholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HighDensityLipoproteinCholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LowDensityLipoproteinCholesterol，LDL-C)水平。

7、
　　3.葡萄糖耐受量試驗(yàn)(GlucoseToleranceTest，GTT)安樂死前3天，動(dòng)物白天饑餓6小時(shí)后，進(jìn)行葡萄糖耐受量試驗(yàn)。每組隨機(jī)選取5只小鼠腹腔注射葡萄糖（2g/kg，20％葡萄糖濃度）。分別于葡萄糖注射0，10，30，60，90和120分鐘尾靜脈取血，采用OneTouchUltraglucometer血糖儀（Johnson&Johnson強(qiáng)生）測(cè)量血糖。通過減去各個(gè)小鼠葡萄糖注射前的基礎(chǔ)血糖獲得血糖變化值，并根據(jù)

8、時(shí)間點(diǎn)，繪制血糖變化曲線。使用梯形規(guī)則線性方法(thelinearmethodofthetrapezoidrule)來(lái)計(jì)算曲線下面積(theAreaUndertheCurve，AUC)。
　　4.取材將小鼠0.8％戊巴比妥鈉麻醉后，剪開胸腔暴露心臟。左心室心尖部用1mL無(wú)菌空針取血后用NS(NormalSaline，生理鹽水)沖洗5分鐘。后用4％甲醛沖洗7分鐘（冰凍組織不灌注甲醛）。取心臟和全長(zhǎng)主動(dòng)脈置于液氮或者甲醛中。去除全長(zhǎng)主

9、動(dòng)脈周圍的脂肪和肌肉組織。分別用石蠟和OCT(OptimumCuttingTemperature，優(yōu)化切片溫度)包埋劑(TissueOCT-FreezeMedium，德國(guó)徠卡Leica)包裹脫水的主動(dòng)脈根部，切片。其他組織凍于-80℃用于提取RNA和蛋白。
　　5.組織病理學(xué)染色將全長(zhǎng)主動(dòng)脈進(jìn)行大體油紅O染色。取主動(dòng)脈根部石蠟和冰凍切片，進(jìn)行H&E染色(HematoxylinandEosin)，油紅O，苦味酸天狼猩紅(Sirius

10、-Red)和Masson，s-trichrome染色分別觀察斑塊大小，脂質(zhì)成分，總膠原和Ⅰ型膠原含量。
　　6.免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)主動(dòng)脈根部平滑肌抗原(α-SmoothMuscleActin，α-SMA)、巨噬細(xì)胞(Macrophage，MAC)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MonocyteChemotacticProtein-1，MCP-1)，Endomucin、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MatrixMetallopr

11、oteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TissueInhibitorofMetalloproteinase-1，TIMP-1)抗原的表達(dá)。
　　7.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay，ELISA）全血離心后吸出血清，置于-80℃冰箱備用。隨機(jī)選取每組6只小鼠采用ELISA試劑盒測(cè)量IL-6的血清水平。
　　8.實(shí)時(shí)定量PCR根據(jù)說(shuō)明使用TRIzol提取主動(dòng)

12、脈總RNA。定量后逆轉(zhuǎn)為cDNA。用SYBRGreen試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)MMP-9，MCP-1，腫瘤壞死因子-α(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)在組織中的表達(dá)變化。小鼠管家基因β-actin作為內(nèi)參。通過2-△△CT方法來(lái)檢測(cè)各基因表達(dá)水平變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。引物序列參見表1。
　　9.蛋白印跡分析用加入了磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解組織提取蛋白質(zhì)，BCA的方法測(cè)量蛋白濃度。進(jìn)而電泳轉(zhuǎn)膜

13、，封閉，孵育一抗二抗顯色，測(cè)量α-SMA;MAC;CollagenⅠ和β-actin蛋白的相對(duì)含量。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式呈現(xiàn)。使用的統(tǒng)計(jì)方法有配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析。p＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用的統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS18.0。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建糖尿病ApoE-/-小鼠模型，該模型合并糖耐量受損
　　與注射檸檬酸緩沖液的ApoE-/-小鼠相比，持續(xù)小劑

14、量STZ注射的正常飲食飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血糖明顯升高。糖耐量檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常飲食飼養(yǎng)的非糖尿病ApoE-/-小鼠比較，STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠糖耐量受損明顯。
　　2.STZ誘導(dǎo)聯(lián)合正常飲食降低ApoE-/-小鼠體重和脂質(zhì)水平
　　注射STZ之前，糖尿病組和非糖尿病組ApoE-/-小鼠體重、血糖、TG和TC水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小劑量STZ注射后ApoE-/-小鼠體重即出現(xiàn)下降。安樂死前糖尿病ApoE-/

15、-小鼠（23周齡）體重顯著低于非糖尿病組ApoE-/-小鼠。與血糖變化類似，小劑量STZ注射后3周血清總膽固醇水平較非糖尿病組顯著升高，并持續(xù)至安樂死前。糖尿病ApoE-/-小鼠TG水平也較對(duì)照組增高。體重和生化指標(biāo)詳見表2。
　　3.STZ誘導(dǎo)聯(lián)合正常飲食促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變
　　大體油紅O染色顯示:正常飲食的非糖尿病組ApoE-/-小鼠整個(gè)主動(dòng)脈AS斑塊病變輕微，但糖尿病組ApoE-/-小鼠整個(gè)主動(dòng)脈A

16、S斑塊明顯增加。連續(xù)切片橫切面HE染色顯示糖尿病ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊病變面積也較對(duì)照組明顯增加。
　　4.STZ誘導(dǎo)聯(lián)合正常飲食改變ApoE-/-小鼠斑塊組成成分
　　局部橫切面連續(xù)切片免疫組化染色顯示:糖尿病組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞含量較對(duì)照組顯著增加，血管壁平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多。糖尿病組ApoE-/-小鼠總膠原含量也增加，其中Ⅰ型膠原含量高于非糖尿病ApoE-/-小鼠。Westernblot

17、分析也顯示了增加的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和Ⅰ型膠原含量。同時(shí)檢測(cè)到糖尿病組ApoE-/-小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，且內(nèi)皮完整性降低。免疫組織化學(xué)染色顯示糖尿病組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部MMP-2含量顯著增高，而TIMP-1含量顯著降低，RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)糖尿病組ApoE-/-小鼠血管組織MMP-9mRNA水平升高。與非糖尿病組比較，MMP-2/TIMP-1比值在糖尿病組ApoE-/-小鼠顯著升高。
　　5.STZ誘導(dǎo)聯(lián)合正常

18、飲食促進(jìn)ApoE-/-小鼠機(jī)體炎癥狀態(tài)
　　與非糖尿病小鼠相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠其血清MIF和IL-6水平顯著升高。免疫組化分析顯示糖尿病組ApoE-/-小鼠血管組織MCP-1含量增加。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)糖尿病組ApoE-/-小鼠血管組織TNF-α和MCP-1的mRNA水平顯著上調(diào)。
　　結(jié)論
　　STZ誘導(dǎo)糖尿病聯(lián)合正常飲食加重ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變，增加斑塊內(nèi)脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞的沉積，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞

19、增殖，加劇機(jī)體炎癥狀態(tài)。
　　第二部分MIF基因干擾改善糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化研究
　　研究背景及目的:
　　近年來(lái)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率和死亡率增高，已越發(fā)引起人們的關(guān)注。然而，糖尿病加速血管性疾病的機(jī)制尚未闡明。作為多效因子，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MacrophageMigrationInhibitoryFactor，MIF）參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程。已知MIF具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞活化和多種炎癥因子

20、表達(dá)的作用。局部聚集的白細(xì)胞及其表達(dá)的各種促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化病變過程。而在2型糖尿病(DiabetesMellitus，DM)患者血清中可以檢測(cè)到升高的MIF水平。本研究提出如下假說(shuō):MIF參與糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。本研究擬采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠作模型，采用正常喂養(yǎng)。將構(gòu)建成功的糖尿病ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為Ad-MIFi，Ad-EGFP和生理鹽水(NormalSaline，NS)組

21、（n≧33/組）。注射檸檬酸鹽緩沖液的ApoE-/-小鼠作為非糖尿病對(duì)照組。4周后重復(fù)尾靜脈注射Ad-MIFi，Ad-EGFP和NS。分別采用ELISA，病理組織染色，Westernblot和RT-PCR等方法比較正常飲食的各組糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變情況，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.建立ApoE-/-小鼠糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型ApoE-/-小鼠，雄性，8周齡，22±2g，110只，購(gòu)于

22、北京大學(xué)。獲取ApoE-/-小鼠尾巴組織提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定其基因型。小鼠均飼養(yǎng)于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管重構(gòu)與功能研究實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。普脂喂養(yǎng)，不限水限食，共喂養(yǎng)15周后進(jìn)行安樂死。所有小鼠適應(yīng)性普脂喂養(yǎng)兩周后開始干預(yù)。連續(xù)5天腹腔注射STZ。利用STZ的毒性作用破壞小鼠β胰島細(xì)胞進(jìn)而升高血糖。僅注射檸檬酸鹽緩沖液的ApoE-/-小鼠(n=36)設(shè)為非糖尿病對(duì)照組。建模方法同第一部分。尾靜脈取血，采用血糖儀測(cè)量血糖。連續(xù)4

23、周血糖高于15mmol/L者入選糖尿病組(n=110)。
　　2.動(dòng)物分組血糖達(dá)標(biāo)且穩(wěn)定的糖尿病小鼠（15周齡）隨機(jī)分為三組:Ad-MIFi(n=36)，Ad-EGFP(n=37)和生理鹽水組(n=37)。分別將腺病毒Ad-MIFi(4×109Pfu)或Ad-EGFP(4×109Pfu)稀釋100μL后尾靜脈注射到Ad-MIFi和Ad-EGFP組小鼠體內(nèi)。尾靜脈注射NS100μL作為糖尿病NS對(duì)照組。4周后重復(fù)上述注射。小鼠于第2

24、次病毒注射4周后安樂死取材進(jìn)行后續(xù)研究。
　　3.體重、血糖和血生化指標(biāo)檢測(cè)分別于STZ注射前和安樂死前檢測(cè)每組小鼠體重、血糖和血清總膽固醇(TotalCholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HighDensityLipoproteinCholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LowDensityLipoproteinCholesterol，LDL-C)水平。

25、
　　4.葡萄糖耐受量試驗(yàn)(GlucoseToleranceTest，GTT)取材前3天，動(dòng)物白天饑餓6小時(shí)后，進(jìn)行葡萄糖耐受量試驗(yàn)。每組隨機(jī)選取5只小鼠腹腔注射葡萄糖（2g/kg，濃度20％）。分別在葡萄糖注射0、10、30、60、90和120分鐘通過尾靜脈采用血糖儀OneTouchUltraglucometer，美國(guó)強(qiáng)生公司）測(cè)量血糖。不同時(shí)間點(diǎn)血糖減去各小鼠葡萄糖注射前的基礎(chǔ)血糖計(jì)算出血糖變化值，并根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)，繪制血糖變

26、化曲線。計(jì)算曲線下面積（AreaUndertheCurve，AUC）。
　　5.取材將小鼠戊巴比妥鈉麻醉后，打開胸腔暴露心臟。左心室心尖部用1mL無(wú)菌空針取血后用NS(NormalSaline，生理鹽水)沖洗全身血液5分鐘。后用4％甲醛沖洗7分鐘（冰凍組織不灌注甲醛）。取心臟和全長(zhǎng)主動(dòng)脈置于液氮或者甲醛中。去除全長(zhǎng)主動(dòng)脈周圍的脂肪和肌肉組織。分別用石蠟和組織冰凍切片OCT(OptimumCuttingTemperature，優(yōu)化的

27、切片溫度)包埋劑(TissueOCT-FreezeMedium)包裹脫水的主動(dòng)脈根部，切片。其他組織凍于-80℃用于mRNA和蛋白水平檢測(cè)。
　　6.組織病理學(xué)染色將全長(zhǎng)主動(dòng)脈進(jìn)行大體油紅O染色。取主動(dòng)脈根部石蠟和冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色、H&E染色(HematoxylinandEosin)、Masson，s-trichrome染色及苦味酸天狼猩紅(Sirius-Red)染色分別觀察斑塊大小、脂質(zhì)成分、總膠原和Ⅰ型膠原含量。

28、>　　7.免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)主動(dòng)脈根部MIF及其配體CD74、平滑肌細(xì)胞抗原（α-SmoothMuscleActin，α-SMA）、巨噬細(xì)胞(Macrophage，MAC)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MonocyteChemotacticProtein-1，MCP-1)、Endomucin、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MatrixMetalloproteinase-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TissueI

29、nhibitorofMetalloproteinase-1，TIMP-1)抗原的表達(dá)。
　　8.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay，ELISA)全血離心后吸出血清，置于-80℃冰箱備用。隨機(jī)選取每組6只小鼠采用試劑盒進(jìn)行血清MIF和IL-6含量測(cè)量。
　　11.實(shí)時(shí)定量PCR使用TRIzol根據(jù)說(shuō)明提取主動(dòng)脈總RNA。定量后逆轉(zhuǎn)為eDNA。用SYBRGreen試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PC

30、R技術(shù)，檢測(cè)MIF，CD74，MMP-9，MCP-1，腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）在組織中表達(dá)的相對(duì)含量。小鼠管家基因β-actin作為內(nèi)參。通過計(jì)算2-△△CT方法來(lái)檢測(cè)各基因水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。引物序列參見表1。
　　9.蛋白印跡分析用加入了磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解組織提取蛋白質(zhì)，然后用BCA的方法測(cè)量蛋白濃度。電泳轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗、顯色，測(cè)量MIF，CD74，α

31、-SMA，MAC，CollagenⅠ和β-actin蛋白的相對(duì)含量。
　　10.人冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)染色分別對(duì)尸檢獲得的單純AS患者和AS合并DM患者左冠狀動(dòng)脈前降支(LeftAnteriorDescending，LAD)進(jìn)行HE，苦味酸天狼猩紅和Masson等病理學(xué)染色和α-SMA，巨噬細(xì)胞，MIF，CD74等免疫組織化學(xué)染色。
　　11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式呈現(xiàn)。使用的統(tǒng)計(jì)方法有配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方

32、差分析。p＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用的統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS18.0。
　　研究結(jié)果:
　　1.STZ誘導(dǎo)糖尿病ApoE-/-小鼠和腺病毒尾靜脈注射
　　與非糖尿病ApoE-/-小鼠相比，14周齡的糖尿病小鼠（STZ注射后3周）其血糖上升，伴有血清膽固醇水平明顯增高。這種高血糖狀態(tài)持續(xù)到整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。糖尿病ApoE-/-小鼠血清TC水平與非糖尿病ApoE-/-小鼠相比亦明顯增高。免疫組織化學(xué)顯示，糖尿病ApoE

33、-/-小鼠MIF水平明顯高于非糖尿病小鼠。RT-PCR結(jié)果也證實(shí)DM組MIF的mRNA水平亦升高。因此高糖可以增加ApoE-/-小鼠MIF水平。Westernblot分析進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病組增加的MIF蛋白水平，同時(shí)糖尿病組小鼠血清MIF水平在也升高。作為MIF的配體，糖尿病組小鼠CD74蛋白和mRNA水平較對(duì)照組增高，免疫組織化學(xué)，Westernblot和RT-PCR檢測(cè)也得到一致結(jié)果。MIF基因干擾組MIF的水平下降，免疫組織化學(xué)和

34、Westernblot方法顯示MIF蛋白水平下降，RT-PCR分析也顯示下調(diào)的MIFmRNA水平。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示小鼠血清MIF水平下降。而DM-NS組和DM-Ad-EGFP組之間比較血清MIF水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但DM-Ad-MIFi組CD74的蛋白和mRNA水平表達(dá)下降。而Jab1水平在DM-NS組，DM-Ad-EGFP組和DM-Ad-EGFP組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　2.MIF基因沉默改善糖尿病ApoE-/-小鼠脂

35、質(zhì)代謝和葡萄糖糖耐量
　　在本實(shí)驗(yàn)中，MIF基因干擾后未影響糖尿病ApoE-/-小鼠的體重。但是，MIF基因可干擾降低血糖和甘油三酯水平。腹腔GTT方法顯示MIF基因干擾可有效改善糖耐量。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，在Ad-MIFi組，與14周齡ApoE-/-小鼠相比，23周齡ApoE-/-小鼠TC水平明顯下降。但是，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，血LDL-C、HDL-C水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體重和生化指標(biāo)詳見表2。
　　3.MIF基因沉默改善糖尿病

36、ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變
　　大體油紅O染色顯示:與Ad-EGFP小鼠相比，MIF基因干擾組AS斑塊面積與血管面積比值出現(xiàn)顯著下降。主動(dòng)脈根部組織連續(xù)切片行HE染色和油紅O染色也證實(shí)DM-Ad-MIFi組局部AS斑塊面積比值明顯低于DM-Ad-EGFP組。表明MIF基因干擾可以改善ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變。
　　4.MIF基因沉默改變糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組成
　　已知油紅O染色顯

37、示脂質(zhì)，免疫組織化學(xué)染色顯示平滑肌和巨噬細(xì)胞含量，Masson染色顯示總膠原，天狼猩紅染色區(qū)分出Ⅰ型膠原。結(jié)果顯示:DM-Ad-MIFi組脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量、總膠原、Ⅰ型膠原和平滑肌細(xì)胞含量均降低。同時(shí)，Westernblot結(jié)果顯示MIF基因干擾后巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、Ⅰ型膠原減少。表明MIF基因干擾可改變動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組成成分。免疫組化染色結(jié)果顯示MIF基因干擾組ApoE-/-小鼠內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加，且內(nèi)皮的完整性改善。
　　

38、5.MIF基因沉默抑制糖尿病ApoE-/-小鼠炎癥因子IL-6，TNF-α和MCP-1表達(dá)
　　本研究發(fā)現(xiàn)MIF基因干擾降低MCP-1mRNA和蛋白水平近正常，而且血清IL-6含量降低。MIF基因干擾組主動(dòng)脈組織TNF-α的mRNA水平也呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。因此，MIF基因下調(diào)炎癥細(xì)胞因子如MCP-1，IL-6和TNF-α表達(dá)，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)。
　　6.MIF基因沉默改善糖尿病ApoE-/-小鼠膠原代謝
　　免疫組化染色顯

39、示:Ad-MIFi組主動(dòng)脈根部MMP-2含量降低而TIMP-1含量增加。RT-PCR顯示糖尿病Ad-MIFi組MMP-9的mRNA水平也降低。MMP-2/TIPM-1比值反映斑塊中基質(zhì)組成。與DM-Ad-EGFP組小鼠相比，MIF基因干擾組MMP-2/TIPM-1比值下降。
　　7.MIF和CD74在2型糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化患者中的表達(dá)變化
　　免疫組化染色顯示，與冠心病病人相比，糖尿病合并冠心病的病人LAD的MIF表達(dá)水