HIGS技術(shù)應(yīng)用于棉花黃萎病防控的探索.pdf

1、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）是重要的土傳病原菌之一，引起多種重要經(jīng)濟作物的黃萎病，給世界棉花生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。目前防控黃萎病的手段主要有化學(xué)防治、輪作倒茬、生物防治、選育抗病品種等。雖有一定成效，但由于黃萎病菌抗逆性強，多有變種，且致病機理復(fù)雜，導(dǎo)致這一病害難以根治。寄主誘導(dǎo)的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）是以RNAi為基礎(chǔ)的，在寄主植物中產(chǎn)生siRN

2、A(small interfering RNA)，隨后進入病原體體內(nèi)發(fā)揮作用，從而特異性沉默病原體基因的一種新技術(shù)，在植物與病原菌（病毒、線蟲、細菌、卵菌、真菌）互作中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并取得很多成果,可能對棉花黃萎病的防治也有重要作用。為此，我們希望利用HIGS技術(shù)沉默黃萎病菌的生長發(fā)育或致病相關(guān)基因，進而達到防治黃萎病的目的。
　　本研究以大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）基因組信息作為依據(jù)，通過文

3、獻查找，初步挑選了9類共91個大麗輪枝菌生長發(fā)育相關(guān)或致病相關(guān)基因作為備選基因，并挑選棉花的ChlI(黃化基因)、CLA1(白化基因)作為陽性對照基因，棉花材料選用陸地棉（Gossypium hirsutum L.）感黃萎病品種新陸早7號，載體選用棉花皺縮病毒(CLCrV)。分別進行了以下實驗：
　　1.利用CLCrV介導(dǎo)的HIGS載體沉默棉花體內(nèi)大麗輪枝菌中的備選基因。將構(gòu)建好的93個 HIGS載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌侵

4、染法接種棉花，之后進行大麗輪枝菌的接種，接種后持續(xù)觀察棉花發(fā)病情況。
　　2.從91個目的基因中挑選11個可能在大麗輪枝菌致病性中發(fā)揮重要作用的基因進行siRNAs實驗，每個基因設(shè)計兩個siRNAs，分別進行體外抑菌實驗和棉花體內(nèi)的抑菌實驗，研究這些基因在大麗輪枝菌侵染棉花中的作用。
　　本實驗主要結(jié)論如下：
　　1.分別采用蘸根法、灌根法、莖注射法對陸地棉新陸早7號進行人工接菌，孢子懸浮液濃度均為1.0×106個孢子

5、/mL，最終發(fā)現(xiàn)莖注射法接種強度適中，發(fā)病情況均一，利于篩選本實驗中相對抗性植株；
　　2.利用棉花皺縮病毒(CLCrV)為中間載體成功構(gòu)建了91個可能與黃萎病菌致病相關(guān)的基因載體，以及棉花中葉綠素相關(guān)基因ChlI(黃化基因)和CLA1(白化基因)的載體。成功沉默了棉花體內(nèi)的ChlI和CLA1基因，棉花葉片分別出現(xiàn)黃化和白化表型，證明了由CLCrV介導(dǎo)HIGS瞬時沉默載體在棉花體內(nèi)可以成功應(yīng)用；
　　3.為了更好地探究目的基

6、因在病原菌與植物互作中的作用，我們從初步篩選并構(gòu)建成功的91個目的基因載體中，選出可能在大麗輪枝菌生長發(fā)育中有重要作用的11個基因，進行深入研究。分別是根部特異表達基因5個，Vd17、Vd19、Vd22、Vd32、Vd155，效應(yīng)子相關(guān)基因3個，Vd64、Vd66、Vd68，cAMP相關(guān)基因3個，Vd86、Vd87、Vd89。每個基因設(shè)計并合成了2個長度為21nt的siRNAs；
　　4.將11個目的基因進行siRNAs體外抑菌實

7、驗。將大麗輪枝菌孢子懸浮液濃度調(diào)整至106 mL-1，在106 mL-1孢子懸浮液中添加siRNAs至終濃度為5μM，將孢子懸浮液濃度調(diào)整為1×103mL-1之后在MM培養(yǎng)基點板培養(yǎng)。與陽性對照和接種含有UR-siRNA的V991組比較發(fā)現(xiàn)，接種含目的基因siRNA的黃萎病菌的菌落生長狀況并無顯著差異，菌落直徑經(jīng)測量也無顯著差異。
　　5.將11個目的基因進行siRNAs棉花體內(nèi)抑菌實驗。于1×106mL-1的孢子懸浮液中添加si