先天性蝸牛殼樣白內障疾病相關候選基因的定位和克隆.pdf

1、隨著當代眼科學手術技術不斷改進和基礎研究的飛速發(fā)展，先天性白內障的診斷、治療及預后都有了很大的提高，但它仍然是導致兒童盲的首要原因。如果不能得到及時和正確的治療，混濁的晶狀體會阻礙物體在視網膜上的清晰成像，影響視網膜皮質突觸連接的發(fā)育，最終導致不可逆的弱視。大約50％的先天性白內障與遺傳有關，其中最常見的遺傳方式是常染色體顯性遺傳[1]，該遺傳方式患者下一代的發(fā)病概率為50％，因此會影響整個家族的生活質量。迄今為止，研究人員已發(fā)現至少1

2、9個候選位點以及14個白內障疾病相關基因與常染色體顯性先天性白內障(autosomal dominant congenital cataract，ADCC)有關，這些基因可以歸為4類：(1)編碼晶狀體蛋白的基因，包括CRYAA[23]、CRYAB[4]、CRYBA1[5,6]、CRYBB1[7]、CRYBB2[8-10]、CRYGC[11,12]、CRYGD[12-16]以及CRYGS[17]；(2)編碼膜轉運及通道蛋白的基因，如MIP

3、[18]，GJA3[19，20]以及GJA8[21,22]； (3)編碼細胞骨架蛋白的基因，如BFSP2[23,24];(4)編碼發(fā)育調節(jié)因子的基因，如PITX3[25]以及HSF4[26]。目前對先天性白內障疾病相關候選基因的研究主要從兩方面著手。一方面從白內障形成相關的功能蛋白出發(fā)，尋找其編碼基因作為突變研究中的重要侯選基因；另一方面對先天性白內障的大樣本家系資料進行基因組掃描和連鎖分析確定染色體定位，再篩選定位區(qū)域內的熱點基因經測

4、序發(fā)現突變點。后者是目前研究先天性白內障疾病相關致病基因的主要方法之一。 本實驗對一個具有特殊表型(蝸牛殼樣混濁)的先天性白內障家系進行了研究，該家系共24人，患者分布于四代中共13人，現存活12人，其中男7人，女5人，均為雙眼發(fā)病。家系中患者均在出生后不久發(fā)病，白內障形態(tài)基本一致。絕大多數患者伴有雙眼眼球震顫，未手術患眼視力最差為手動最好為0.25。另外，家系成員中未發(fā)現其他眼部異常及全身疾病，可基本排除藥物和環(huán)境的影響。因該

5、家系白內障表型獨特，國內、外文獻均未見報道，本實驗擬對該先天性白內障家系進行疾病相關候選基因的定位和克隆研究，以期找到與此獨特先天性白內障表型相關的候選基因，并進一步探討先天性白內障的發(fā)病機制及認識人眼晶狀體發(fā)育和代謝的基因編碼及遺傳規(guī)律，為先天性白內障的產前診斷和基因治療提供理論依據。本實驗獲浙江大學倫理委員會同意，并且所有家系成員均簽署知情同意書。 第一部分:先天性蝸牛殼樣白內障家系所有家系成員均接受病史調查，并行眼科檢查，

6、包括視力、裂隙燈、散瞳眼底檢查等。根據病史、白內障手術史或裂隙燈檢查所見確定成員患病與否。該家系共24人，患者分布于四代中共13人，現存活12人，其中男7人，女5人，均為雙眼發(fā)病。病史及裂隙燈檢查：家系中患者均在出生后不久發(fā)病，白內障形態(tài)基本一致，呈蝸牛殼樣混濁，個別患眼還伴有皮質騎子。絕大多數患者伴有雙眼眼球震顫，未手術患眼視力最差為手動最好至0.25。家系成員均為足月順產，妊娠史均正常，可排除藥物和環(huán)境的影響，無其它眼部和全身病變。

7、根據該家系遺傳特點，無近親結婚、每一代男女都有患者、且男性患者的男性下一代也可患病，我們可以判斷該家系遺傳模式為常染色體顯性遺傳。 第二部分:疾病相關候選基因的定位在家系調查的基礎上，應用短串聯重復序列(微衛(wèi)星位點，short tandem repeats sequence，STRS)為遺傳標記的基因掃描和遺傳連鎖分析技術，進行疾病相關候選基因的定位分析。采集包括12例患者在內的家系成員血樣22份，使用3-Spin Blood

8、DNA Isolation(上海申能博彩生物科技有限公司)試劑盒提取基因組DNA。選取與已知18個常染色體顯性遺傳先天性白內障相關位點鄰近的微衛(wèi)星位點共41個，分別用熒光染料標記的引物進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，ABI PrismTM377XL型DNA：測序儀電泳，Genescan 3.0軟件和Geno typer 2.1(Perkin-Elmer Applied Biosyste

9、m)軟件完成等位基因的分型，運用Linkage 5.10軟件MLink程序進行家系兩點連鎖分析。兩點連鎖分析得出在STRS標記D12S368和D12S83處，當重組率θ=0時其兩點LOD最大值(ZMAX)分別為1.66和2.01，支持連鎖。而ADCC相關基因MIP所在區(qū)域恰好位于這兩個標記點之間。在D12S368和D12S83之間，再選取3個微衛(wèi)星標記D12S1586、D12S1632和D12S1691進行連鎖分析，其中最高LOD值3.

10、08(θ=0)在STRS標記物D12S1632處獲得，屬肯定連鎖關系。 第三部分:疾病相關候選基因的突變篩選通過對該家系先天性白內障疾病相關候選基因MIP(編碼水通道蛋白0，aquaporin0，AQP0)基因篩選測序，顯示在MIP基因第3號內含子3’最后一個堿基發(fā)生了雜合的G→A置換(c．607-1G>A)。在發(fā)現了此改變后，我們對所有的家系成員以及100個與該家系無血緣關系的正常個體進行了限制性片斷長度多態(tài)性分析(Restr

11、iction Fragment Length Polymorphism Analysis，RFLP)。該點突變使原有的一個BstSF1限制性內切酶酶切位點消失，此改變與白內障表型完全共分離：家系中所有患者均有此改變，而健康者均無此改變，并且100個不同遺傳背景的正常對照樣本亦無此改變，提示MIP基因為此獨特表型白內障疾病相關基因。 第四部分: MIP基因3號內含子隱性受體剪接位點的預測因該突變位點恰好位于MIP基因的3號內含子受

12、體剪接位點處，將導致MIP前體mRNA無法正常剪接。通常剪接位點突變會出現外顯子丟失、替代性剪接位點的激活、內含子中出現假外顯子及內含子殘留等改變。用NNSPLICE程序，版本0.9(http：//www．fruitfly．org/seq_tools/splice．html)對該剪接位點的臨近序列進行隱性受體剪接位點評分(分值范圍0～1.0)，預測可能存在的替代性受體剪接位點(評分大于0.4)。結果表明除原有正常受體剪接位點外(評分1.

13、0)，另有兩個隱性剪接位點評分分別為0.44和0.88。當G→A突變發(fā)生時，原正常剪接位點AG變?yōu)閺?，評分也從1.0降至0.0，因此預測的兩個隱形剪接位點有可能被激活。第五部分異常剪接產生突變型MIP蛋白(AQP0)模型的計算機構建和分析水通道蛋白0(AQP 0)是水通道蛋白家族中的一員，其主要功能為跨膜快速轉運水分子。其主要在晶狀體終末分化纖維中表達，并占總膜蛋白的50％以上。AQP0三維結構高度保守，對維持人晶狀體透明性和屈光性具有

14、重要作用。運用SWISS-MODEL軟件以牛AQP0蛋白結構為模板預測野生型和異常剪接型AQP0蛋白結構，用SWISS-Pdb瀏覽器進行觀察與分析。SWISS-MODEL軟件蛋白建模后發(fā)現MIP基因(c．607-1G>A)突變后如激活隱性受體剪接位點，產生突變型蛋白，將導致其第六段跨膜a-螺旋及后續(xù)的羧基端丟失,破壞其正常的沙漏結構及其在細胞膜上的錨定。 結論 1、本研究首次報道了一個中國特殊表型(蝸牛殼樣)先天性白內障

15、大家系，該家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳： 2、首次報道受體剪接位點突變引起的常染色體顯性遺傳性先天性白內障。MIP基因第3號內含子受體剪接位點突變(c．607-1G>A)與該先天性白內障表型共分離，MIP為該先天性白內障家系的疾病相關基因。 3、MIP基因3號內含子隱性受體剪接位點激活后產生的異常剪接蛋白，將導致AQP0第六段跨膜a-螺旋及后續(xù)的羧基端丟失，破壞其正常的沙漏結構及其在細胞膜上的錨定。 4、本實