乳腺癌人源噬菌體抗體庫的構建及初步鑒定.pdf

1、乳腺癌(breast cancer)是女性常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌，有50萬婦女死于乳腺癌，發(fā)病率占全年各種惡性腫瘤的7％～10％。在我國，乳腺癌的發(fā)病率雖較西方國家為低，但近年來亦有上升趨勢。目前，以超聲及X線等為主的乳腺癌診斷方法，對早期乳腺癌的診斷尚缺乏足夠的準確性和特異性。而以手術，化療及放療主的綜合治療又因副作用太大而在臨床應用中受到諸多限制。因此，許多學者把目光投向了乳腺癌的抗體診斷及治療。

2、 近10年來，腫瘤的生物治療已經(jīng)作為一種重要的治療模式被廣泛的研究和應用于臨床。但是，無論是早期利用腫瘤細胞免疫小鼠得到的多克隆抗體，還是以后運用雜交瘤技術生產(chǎn)的單克隆抗體都因為抗體的特異性低或者人抗鼠免疫反應(human anti-murine antibodyresponse,HAMA)等原因而不適用于臨床腫瘤治療。直到1998年FDA正式批準人源化鼠源單克隆抗體赫賽汀(Herceptin)應用于臨床CerBb2受體陽性的乳腺

3、癌的治療，才為腫瘤的抗體治療帶來了新的挈機。但是在臨床使用中發(fā)現(xiàn)這種被寄予厚望的單克隆抗體僅能對30％的Her2/neu陽性的乳腺癌患者產(chǎn)生抗腫瘤效果。Micheu等認為單克隆抗體分子量較大，組織穿透性差，使其在腫瘤部位的濃聚減少是Herceptin治療效果不甚理想的一個重要原因。 1985年Smith提出了噬菌體展示技術的概念及1990年Huse成功的構建第一個噬菌體組合文庫為腫瘤的診斷及治療提供了一種全新的方法。噬菌體單鏈抗

4、體分子量較小、組織穿透性強、能夠迅速到達靶抗原部位，在腫瘤的診斷及治療中有很強的應用價值。但是，目前報道的抗乳腺癌噬菌體抗體庫多為鼠源性，因人抗鼠免疫反應而不適合臨床運用。針對鼠源性單鏈抗體的異源性問題我們嘗試利用乳腺癌患者癌旁淋巴細胞來構建人源乳腺癌抗體文庫，并利用乳腺癌細胞株MCF-7進行篩選。 目的：利用基因工程方法和噬菌體抗體庫技術構建人源乳腺癌單鏈抗體文庫，并從中篩選出特異性的噬菌體單鏈抗體，為乳腺癌的免疫診斷及免疫治

5、療提供新載體。 方法與結(jié)果： 噬菌體抗體文庫的構建： 1．人源單鏈抗體基因文庫的構建：取乳腺癌患者癌旁淋巴結(jié)作為B細胞的來源，提取淋巴細胞的總RNA，通過RT-PCR的方法分別擴增抗體重鏈可變區(qū)(V<,H>)和抗體輕鏈可變區(qū)(V<,L>)基因片斷。再以VH和VL基因片斷為模板分別擴增 V<,H>-linker與V<,L>-linker，然后利用SOE-PCR技術將他們拼接成完整的單鏈抗體(scfv)基因片斷。最后

6、，在抗體基因片斷的兩端引入酶切位點SfiI和NotI。結(jié)果顯示：從乳腺癌癌旁淋巴結(jié)中提取的總RNA在瓊脂糖電泳結(jié)果中可見明顯的28S和18S條帶；V<,H>基因片斷的大小約350bp和V<,L>基因片斷的大小約300bp；組裝后的Scfv基因片段約750bp。 2．噬菌體單鏈抗體庫與噬菌體載體pCANTAB-5E的拼接：制備轉(zhuǎn)化效率達到6.5×10<'7>cfu/ug PUC18的高濃度電轉(zhuǎn)菌 TG1。單鏈抗體基因片斷經(jīng)SfiI

7、和NofI雙酶切后，電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌TG1，結(jié)果獲得4.2×10<'7> cfu/ug氨芐青霉素抗性克隆。隨即進行酶切反應鑒定，陽信插入率為79％(19/24)。隨即測序結(jié)果證實抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準確的插入了載體。 噬菌體抗體文庫的初步篩選： 1．利用正常的人成纖維細胞和乳腺癌細胞MCF-7對抗體庫進行富集篩選：先以正常人成纖維細胞對抗體庫進行負性篩選，然后再利用MCF-7對抗體庫進行富集，共進行了5輪

8、“吸附-洗脫-擴增”富集篩選。得到一個4.2×10<'7>的噬菌體抗體庫，說明特異性的scFv得到了有效富集。 2．噬菌體scfv的ELISA鑒定：對第五輪后的噬菌體抗體隨即進行ELISA檢測，結(jié)果顯示：3/12的克隆呈陽性反應。 結(jié)論：針對鼠源性單鏈抗體在臨床應用中存在的人抗鼠免疫反應的問題，我們嘗試利用噬菌體抗體庫技術構建乳腺癌相關人源單鏈抗體庫，并利用乳腺癌細胞進行初步篩選。結(jié)果表明通過噬菌體抗體庫技術可以直接從腫