熒光原位雜交技術(shù)在輔助生殖中的作用.pdf

1、自1990年世界上誕生第一例胚胎植入前遺傳學(xué)診斷試管嬰兒（preimplantation genetic diagnosis，PGD）至今，已有近20年的歷史。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷是對配子或胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析和診斷，去除有遺傳缺陷的配子或胚胎，選擇正常的胚胎植入子宮的一種診斷方法。PGD將遺傳學(xué)與輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，克服了常規(guī)產(chǎn)前診斷技術(shù)因終止異常妊娠帶給患者身心痛苦的缺陷，因此在輔助生殖技術(shù)中越來越受到重視。同時體外受精——胚胎移植（

2、in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技術(shù)的發(fā)展已日益成熟，也給PGD發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。雖然新的植入前胚胎單細(xì)胞診斷方法不斷出現(xiàn)如比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、array-CGH、Microarray等，但在現(xiàn)階段仍然無法替代PGD中兩個基本方法：單細(xì)胞聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reactio

3、n，PCR）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。由于單細(xì)胞PCR存在三個缺點：PCR擴(kuò)增效率、污染及等位基因脫扣（Allele drop-out，ADO，），而FISH不僅可以進(jìn)行胚胎植入前性別診斷，更在研究胚胎嵌合現(xiàn)象、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常方面具有PCR所沒有的優(yōu)勢。因此FISH是PGD中一種無法替代的、重要的檢測方法。
　　 在FISH-PGD中仍然存在難點：1.

4、單細(xì)胞固定：在單細(xì)胞FISH診斷中，診斷的準(zhǔn)確性與單個卵裂球的固定密切相關(guān)。理想的固定應(yīng)該是徹底的去除胞漿蛋白，保留染色體DNA的完整性且簡單易學(xué)。目前常用的單細(xì)胞固定方法有三種：甲醇/冰醋酸法、 Tween-20/HCl法、Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法。三種固定方法在各個生殖中心分別有使用。但三種方法在實際臨床應(yīng)用中仍然可能出現(xiàn)細(xì)胞核暴露不良、胞漿殘留多、甚至細(xì)胞核丟失導(dǎo)致無法準(zhǔn)確診斷等，因此認(rèn)為固定方法仍需進(jìn)一步改進(jìn)和完

5、善。2.植入前胚胎有高比例的非整倍體，這可能是FISH-PGD臨床誤診、成功率低的重要原因之一。對于高生育風(fēng)險的平衡易位攜帶者夫婦其胚胎非整倍體風(fēng)險文獻(xiàn)報道不一。同時在FISH診斷中信號在核中的位置的臨床意義及其對診斷及胚胎發(fā)育的影響近年來成為研究熱點，但仍然尚無明確定論。3.臨床上染色體異常PGD遺傳咨詢及預(yù)后估計如移植胚胎、妊娠結(jié)局等的研究逐漸成為熱點，但目前進(jìn)展緩慢。
　　 本文就上述熱點和難點問題從以下五個方面進(jìn)行了研究

6、：第一部分對Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法進(jìn)行了改良，并探討了其對FISH信號及單細(xì)胞診斷的影響。第二部分探討了平衡易位攜帶者胚胎中非整倍體的變化及卵裂球細(xì)胞核中染色體信號分布特點。第三部分探討了精子FISH結(jié)果在男性染色體異常PGD及遺傳咨詢中的作用。第四部分將改良的卵裂球固定方法用于臨床，進(jìn)行了16個PGD周期的臨床診斷，同時回顧性分析了染色體平衡易位對控制性超排卵過程中卵巢反應(yīng)性的影響等。第五部分應(yīng)用國產(chǎn)化探針對未培養(yǎng)的

7、羊水細(xì)胞進(jìn)行了FISH分析。
　　 第一部分單細(xì)胞固定方法的改良及其對細(xì)胞核面積及熒光原位雜交信號的影響
　　 研究對象：用于固定卵裂球細(xì)胞均來自不宜移植的人類2-10細(xì)胞階段的胚胎，所有胚胎均經(jīng)過病人知情同意后用于實驗。
　　 研究方法：獲得的卵裂球使用3種不同的固定方法（甲醇/冰醋酸法；Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法；改良的Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法）固定。固定后進(jìn)行FISH，同時利用

8、熒光分析軟件Imstar計算細(xì)胞核面積、比較各組的固定率、信號重疊率、信號分裂率。
　　 結(jié)論：對Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法進(jìn)行了改良，同時對其及另外的卵裂球固定方法進(jìn)行比較，改良的 Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法易于掌握、程序簡單、固定細(xì)胞時間短、不增加誤診率等優(yōu)點可在臨床廣泛推廣使用。
　　 第二部分平衡易位攜帶者胚胎非整倍體篩查及染色體位置與胚胎非整倍體相關(guān)性的研究
　　 研究對象：

9、2006.1～2009.3我中心針對平衡易位攜帶者進(jìn)行11個PGD周期，包括羅伯遜易位9個周期，相互易位2個周期。
　　 研究方法：
　　 1.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷程序按我中心常規(guī)進(jìn)行。
　　 2.對固定好、信號明顯的細(xì)胞核再次選擇5種探針（LSI13/21及CEP18/X/Y），進(jìn)行胚胎非整倍體檢測。
　　 3.采用Imstar熒光分析軟件確定各個信號相對位置。信號相對位置（relative dista

10、nce）RD=SC/R。
　　 結(jié)論：
　　 1.平衡胚胎來源的卵裂球整倍體率為71.4％，明顯高于非平衡胚胎來源的卵裂球整倍體率（9.1％）。
　　 2.不同級別胚胎的卵裂球其整倍體率無顯著差異，即使移植了優(yōu)質(zhì)胚胎仍然可能是非整倍體胚胎，最終導(dǎo)致妊娠失敗。本研究顯示優(yōu)質(zhì)胚胎非整倍體率仍占有60％，高于文獻(xiàn)報道。因此對于針對平衡易位的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷建議同時進(jìn)行胚胎的非整倍體篩查。
　　 3.本研究顯

11、示整倍體卵裂球中染色體信號分布無顯著差異。
　　 4.非整倍體細(xì)胞核中，染色體信號分布主要在核周邊。信號13、18、21、Y傾向分布于外周，尤其是染色體18號，信號X的分布無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 第三部分精子熒光原位雜交在男性染色體異常PGD中的作用
　　 研究對象：
　　 2006.7～2008.8，9對不孕夫婦因男方染色體異常進(jìn)行了精子熒光原位雜交分析和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，包括羅氏易位7例，相互易位1

12、例，克氏綜合征1例。所有病例女方染色體均正常?；颊呓?-5天手淫法取得的精液標(biāo)本用于試驗。所有患者均知情同意后行精子FISH和PGD。
　　 研究方法：
　　 1.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷程序按我中心常規(guī)進(jìn)行。
　　 2、精子預(yù)處理：精液預(yù)處理后用甲醇/冰醋酸（3：1）固定液調(diào)制精子濃度至20×106/ml，后滴片，使精子均勻分布于玻片并風(fēng)干。后將風(fēng)干玻片在1M NaOH溶液中浸泡5分鐘，使精子核去凝集，后立即進(jìn)行

13、FISH分析。
　　 3. FISH方法同第一部分。
　　 結(jié)論：
　　 1.羅伯遜易位攜帶者平衡精子平均比例為85.7％，克氏綜合癥患者的正常或平衡精子比例為68.8％，均高于相互易位攜帶者。
　　 2.染色體正常精子比例與PGD中正常胚胎比例呈正相關(guān)，因此在PGD前生殖遺傳咨詢中，建議對攜帶者進(jìn)行精子熒光原位雜交分析，了解平衡配子所占的比例，為PGD的應(yīng)用提供客觀依據(jù)。
　　 第四部分胚胎植入

14、前遺傳學(xué)診斷16個周期的臨床應(yīng)用分析
　　 研究對象：2006.1～2009.3年，我中心共進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷16個周期，包括針對染色體羅伯遜易位9個周期，針對染色體相互易位2個周期，針對男性克氏綜合癥2個周期，針對男方AZFc缺失1個周期，針對21-三體高風(fēng)險篩查2個周期。
　　 研究方法：所有周期均經(jīng)控制性超排卵、取卵、ICSI技術(shù)受精，受精后用Quinn's-1026培養(yǎng)液培養(yǎng)。受精后第三天觀察胚胎發(fā)育情況，

15、合適胚胎采用激光打孔法進(jìn)行活檢?？苫顧z胚胎的標(biāo)準(zhǔn)為正常受精并發(fā)育到6-8細(xì)胞以上，碎片<20％取1-2個卵裂球?；顧z出的卵裂球移入礦物油覆蓋培養(yǎng)液Quinn's-1023微滴的培養(yǎng)皿（3001培養(yǎng)皿）準(zhǔn)備行改良的Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法固定。固定后選擇相應(yīng)探針雜交。相應(yīng)的活檢后的胚胎移入Quinn's-1029微滴中繼續(xù)培養(yǎng)。D5根據(jù)FISH信號和胚胎質(zhì)量等移植相應(yīng)胚胎。
　　 結(jié)論：
　　 1.平衡易位

16、攜帶者有較高比例的無規(guī)律分裂的胚胎，此類患者PGD在保障胚胎發(fā)育潛能的前提下傾向活檢2個卵裂球以提高診斷的準(zhǔn)確性。
　　 2.染色體羅伯遜易位可能是卵巢反應(yīng)不良的風(fēng)險因素之一。
　　 3.改良的Tween-20/HCl+甲醇/冰醋酸法應(yīng)用于臨床16個胚胎植入前遺傳學(xué)診斷周期，4例獲得妊娠，使其實現(xiàn)生育健康后代的愿望，達(dá)到優(yōu)生的目的。
　　 第五部分未培養(yǎng)羊水細(xì)胞FISH在產(chǎn)前遺傳性疾病檢測中的應(yīng)用
　　

17、研究對象：
　　 2007～2008年來我院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的100例孕婦，年齡范圍25-40歲，孕周范圍17-25周。羊膜腔穿刺指征包括：1、孕婦年齡大于或等于35歲；2、孕婦曾經(jīng)生育過染色體異常兒；3、夫婦一方有染色體結(jié)構(gòu)異常；4、母血清生化篩查高風(fēng)險；5、超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常。并排除穿刺的禁忌癥如具有先兆流產(chǎn)癥狀、體溫高于37.5℃、有出血或盆腔宮腔感染征象者。
　　 研究方法：
　　 1.進(jìn)行羊水核型分析及熒

18、光原位雜交的產(chǎn)前診斷病例共100例。孕婦的年齡25-40歲，孕周范圍17-25周。
　　 2.羊水核型分析采用常規(guī)方法，由河南省人民醫(yī)院遺傳研究所完成。
　　 3.未培養(yǎng)羊水細(xì)胞FISH檢測方法按照探針說明進(jìn)行。
　　 結(jié)論:
　　 1.未培養(yǎng)羊水細(xì)胞行FISH分析是可行的、可靠的。本研究中，針對特異探針而言，染色體非整倍體的診斷準(zhǔn)確率達(dá)100％。該技術(shù)簡便快速，能在24小時內(nèi)出結(jié)果，有很大的應(yīng)用前景。<