葛根素涂層支架對再狹窄的防治及其分子機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的高死亡率和高致殘率，已成為嚴(yán)重危害我國人民健康的主要疾病，因此加強(qiáng)對冠心病的研究，具有極大的必要性和迫切性。支架安置術(shù)作為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)球囊擴(kuò)張成形術(shù)(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)后的補(bǔ)充用于臨床，有效降低了PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生率。但支架安置術(shù)后支架內(nèi)再狹窄ISR(in-stentrestenosis，ISR)發(fā)生率

2、仍高達(dá)15％～20％。其發(fā)病的病理機(jī)制為：支架植入過程可使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，受損的內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)附壁血栓的形成，同時(shí)釋放各種血管活性物質(zhì)、生長因子、粘附分子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，白介素-6(interleukin，IL-6)、粘附分子細(xì)胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule，ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vasc

3、ularcelldhensionmolecule，VCAM-1)等。這些細(xì)胞因子可促進(jìn)血管收縮，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vesselsmoothmuslecell，VSMC)由中膜遷移到內(nèi)膜并增殖，同時(shí)啟動(dòng)一系列血管損傷后修復(fù)反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)膜增厚，形成支架內(nèi)再狹窄。因此，血栓形成、內(nèi)膜增厚、血管重塑三個(gè)時(shí)期構(gòu)成ISR的發(fā)病主要病理過程。 目前臨床應(yīng)用的藥物涂層支架主要有雷帕霉素涂層支架及紫杉醇涂層支架。紫杉醇通過阻止微管斷裂，造成細(xì)胞

4、凋亡而抑制VSMC增殖，從而抑制內(nèi)膜增殖；但其在血管壁內(nèi)的長期存在可導(dǎo)致動(dòng)脈血管壁壞死和動(dòng)脈瘤形成，阻礙了其在臨床的廣泛應(yīng)用。雷帕霉素可使細(xì)胞分裂受阻于G1期而不能進(jìn)入S期，抑制VSMC細(xì)胞增殖，大大降低了ISR的發(fā)生率，但發(fā)生晚期血栓的幾率較高，可能與其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)時(shí)間延長有關(guān)。同時(shí)，雷帕霉素涂層支架的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我國普通大眾的經(jīng)濟(jì)承受能力，因而有必要尋求一種適合我國生活水平且療效較好的藥物涂層支架。

5、葛根素(Puerarin，Pur)為異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，現(xiàn)代藥理研究證明，葛根素在心血管中具有多種功能，主要有抗血小板活性，改善纖溶酶活性及減輕炎癥反應(yīng)的作用；使內(nèi)皮細(xì)胞羥脯氨酸代謝減慢，減少內(nèi)壁膠原形成，有利于防止血小板粘附、聚集和血栓形成；葛根素注射液可使冠心病心絞痛患者冠脈內(nèi)NO水平明顯升高，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。本課題前期研究證實(shí)，葛根素可促進(jìn)VSMC凋亡，在血管損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，治療組血管內(nèi)膜面積顯著低于模型組

6、(P＜0.05)，由此推測葛根素可抑制血管內(nèi)膜的增厚。 二、研究目的及意義本實(shí)驗(yàn)通過觀察葛根素對VSMC增殖、遷移以及內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的影響，旨在探討葛根素抑制支架內(nèi)再狹窄的作用機(jī)制；通過觀察葛根素涂層支架對兔髂動(dòng)脈球囊損傷后VSMC增殖和內(nèi)膜增厚的影響，目的在于為該支架進(jìn)一步的臨床開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 三、研究內(nèi)容本課題擬進(jìn)行以下三方面的實(shí)驗(yàn)研究：(1)探討葛根素對VSMC增殖與遷移的影響；(2)探討葛根素對血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)

7、的影響；(3)初步探討葛根素涂層支架對家兔髂動(dòng)脈球囊拉傷模型再狹窄的影響。 四、研究方法1.培養(yǎng)VSMC，采用MTT法觀察葛根素對由凝血酶誘導(dǎo)的VSMC生長的影響，流式細(xì)胞法觀察其對VSMC的細(xì)胞周期的影響，確定其對VSMC增殖的影響。在此基礎(chǔ)上探討其對VSMC細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21Cip1表達(dá)的影響；通過由凝血酶誘導(dǎo)的VSMC遷移模型，觀察其對細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(maxtrixmetalloproteinases，MMPs)

8、MMP-2和MMP-9的影響。2.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVE)，采用MTT法觀察葛根素對由凝血酶誘導(dǎo)的HUVE生長的影響，流式細(xì)胞法觀察其對HUVEC的細(xì)胞周期的影響，確定其對HUVE增殖的影響。在此基礎(chǔ)上探討其對由凝血酶誘導(dǎo)的HUVEC分泌的MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及NO的影響。 3.在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，將葛根素注射劑原粉，制

9、成藥物涂層支架(上海微創(chuàng)協(xié)作完成)，選擇大耳白兔先行髂動(dòng)脈球囊拉傷作為模型組，然后行髂動(dòng)脈支架植入術(shù)，用裸支架為對照組，觀察葛根素涂層支架對再狹窄的防治作用。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.葛根素可抑制凝血酶誘導(dǎo)的VSMC增殖，在抑制VSMC增殖過程中，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)高濃度組可有增加p21Cip1蛋白表達(dá)的趨勢，抑制CDK-2蛋白的趨勢；在抑制VSMC遷移的過程中可抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)(與模型組相比P＜0.05)； 2

10、.葛根素可抑制凝血酶誘導(dǎo)的HUVE增殖，抑制細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、高濃度組可促進(jìn)HUVE分泌NO(與模型組相比P＜0.05)； 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與球囊拉傷組相比，葛根素涂層支架可顯著改善管腔面積，抑制內(nèi)膜增殖(P＜0.05)，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)其可明顯增加VSMC的p21Cip1蛋白表達(dá)，抑制CDK-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞因子IL-6表達(dá)的趨勢，有促進(jìn)VEGF表達(dá)的趨勢。 六、結(jié)論1

11、.葛根素可能通過增加細(xì)胞周期調(diào)控p21Cip1蛋白表達(dá)，抑制CDK-2蛋白表達(dá)，抑制VSMC增殖，在抑制VSMC遷移過程中，抑制VSMC分泌MMP-2和MMP-9的表達(dá)。 2.葛根素可抑制HUVE增殖，可能與其抑制細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)，促進(jìn)HUVE分泌NO。 3.葛根素涂層支架可改善管腔面積，抑制內(nèi)膜增殖，這可能與其抑制VSMC增殖有關(guān)，推測其抑制VSMC增殖可能又與其增加p21C