乳腺癌細胞中HSP90α的分泌及其作用機制.pdf

1、引言：
　　熱休克蛋白90α(HSP90α)的研究是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。HSP90α是一種細胞內(nèi)高表達的分子伴侶蛋白質(zhì)，能與100多種目的分子結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞各項生理功能。雖然人們研究HSP90α幾十年，都知道細胞內(nèi)HSP90α的含量非常巨大，但是細胞內(nèi)HSP90α含量究竟是多少，卻沒有學(xué)者用實驗的方法來測定。另外，人們普遍認同很多腫瘤細胞能分泌HSP90α至細胞外，分泌型HSP90α反作用于細胞，影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為?？墒?，腫

2、瘤細胞的HSP90α分泌機制以及分泌的HSP90α如何反作用于細胞，這樣的研究卻相對較少。在此，我們實驗室設(shè)計本實驗，對以上問題做一探討。
　　目的：
　　1.通過實驗的手段測定不同細胞內(nèi)HSP90α的含量，以期獲得較準確的數(shù)據(jù)，解決HSP90α研究領(lǐng)域中一個重要的但卻被人們忽略的問題。
　　2.觀察腫瘤細胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF,HIF-1α和HIF-1β)對腫瘤細胞分泌HSP90α的影響。
　　3.檢測分泌至

3、細胞外的HSP90α是否依賴低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）對腫瘤細胞發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控。
　　方法：
　　1.將已知量的重組人HSP90α純蛋白與細胞裂解液同時跑膠，用Westernblot法讓它們在同一張膠片上曝光，通過比較膠片上細胞裂解液組與HSP90α純蛋白組的各點曝光斑密度值，計算細胞裂解液中HSP90α的含量。
　　2.培養(yǎng)乳腺癌細胞MDA-MB-231，用小干擾RNA(siRNA)分別下調(diào)細胞內(nèi)HIF-

4、1α和HIF-1β的表達水平，Westernblot法檢測細胞分泌HSP90α的情況。
　　3.培養(yǎng)乳腺癌細胞MDA-MB-231，用小干擾RNA(siRNA)分別下調(diào)細胞內(nèi)HIF-1α、HIF-1β和LRP1的表達水平，進行細胞遷移和侵襲實驗，觀察分泌型HSP90α對細胞的作用及其作用機制。
　　4.活體動物實驗：使用嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCIDMice)作實驗?zāi)Ｐ?，?×106個熒光素酶標記的腫瘤細胞(MDA-MB-2

5、31-Luc和MDA-MB-468-Luc)從尾靜脈注入小鼠。設(shè)計實驗組小鼠注射MDA-MB-231-Luc細胞；對照組小鼠注射經(jīng)siRNA下調(diào)了CD91水平的MDA-MB-231-Luc細胞和天生缺失CD91表達的MDA-MB-468-Luc細胞，在不同時間點進行活體成像監(jiān)測。
　　結(jié)果：
　　1.細胞內(nèi)HSP90α的含量：
　　HDF:2.33％±0.16;HKC:2.35％±0.26;HEMN-LP:2.25％±

6、0.62;HBL-100:3.47％±0.36;SCC-12:3.79％±1.31;MDA-MB-231:3.66％±0.21;A431:4.53％±0.70;M24:6.77％±1.56.
　　2.用siRNA下調(diào)HIF-1α或HIF-1β都能抑制MDA-MB-231細胞分泌HSP90α，此時的細胞遷移和侵襲能力降低。
　　3.下調(diào)了LRP1表達水平的MDA-MB-231細胞侵襲能力下降。
　　4.活體成像監(jiān)測顯示：

7、與注射下調(diào)了CD91水平的MDA-MB-231-Luc細胞和天生缺失CD91表達的MDA-MB-468-Luc細胞的對照組小鼠相比，注射MDA-MB-231-Luc細胞的實驗組小鼠表現(xiàn)出較強的成瘤能力。
　　結(jié)論：
　　1.正常細胞內(nèi)HSP90α占細胞總蛋白含量的2-3％；而腫瘤細胞內(nèi)HSP90α則占細胞總蛋白含量的3-7％。
　　2.MDA-MB-231腫瘤細胞表達HIF-1α→HIF-1α進核與HIF-1β結(jié)合形成