長效HIV融合抑制劑的設計、評價及其作用機制研究.pdf

1、多肽類HIV融合抑制劑——T20（藥品通用名:恩夫韋肽）已用于臨床治療艾滋病，但由于該多肽藥物半衰期短、藥效低、生產(chǎn)成本高，從而限制了其臨床應用。近年來，一系列更高效率的多肽類HIV融合抑制劑，如T1144，被開發(fā)出來，然而其半衰期相對較短和生產(chǎn)成本高的缺點仍然是制約多肽HIV融合抑制劑藥物發(fā)展的瓶頸。如何設計長效且生產(chǎn)成本比多肽藥物低的非多肽HIV融合抑制劑成為未來HIV融合抑制劑研發(fā)領域的關鍵科學問題。
　　本研究設計出一個長

2、效的蛋白類HIV融合抑制劑——FLT(FN3-L35-T1144)。FLT是由三個蛋白片段（或多肽）組成，即FN3、L35和T1144。FN3為具有獨特結構的擬抗體，其分子量小，可以與人血清白蛋白(Human SerumAlbumin)發(fā)生可逆性結合，從而達到延長體內(nèi)半衰期的作用。T1144為第三代多肽類HIV融合抑制劑，具有比T20更高效的抗HIV-1病毒活性。L35是由35個氨基酸構成的連接肽，它把FN3和T1144連接在一起形成一

3、個新的蛋白類HIV融合抑制劑——FLT(FN3-L35-T1144)。我們的試驗結果證明FLT具有高效、廣譜的抗HIV-1活性，在體內(nèi)的半衰期明顯延長。此外，F(xiàn)LT重組蛋白可以在大腸桿菌（原核系統(tǒng)）中大量可溶性地表達，大大降低了HIV融合抑制劑藥物生產(chǎn)成本。因此，使用擬抗體技術可顯著延長HIV融合抑制劑的半衰期，降低藥物的生產(chǎn)及治療成本，為解決多肽藥物的開發(fā)瓶頸提供新的解決方法。
　　本研究主要圍繞HIV融合抑制劑的長效性研究展開

4、，主要結論如下:
　　以pPBHFT-Fn3-FG和PGEX-6P-1MD1.1-L35-T1144質(zhì)粒為模板，成功構建了重組蛋白FLT。目的蛋白在原核表達系統(tǒng)中可獲得大量表達（絕大部分以上清表達為主，不溶的包涵體形式很少）。通過連接擬抗體FN3結構域，可以促進高度疏水序列T1144的原核表達產(chǎn)量。擬抗體FN3結構域利用其自身的高表達性，作為分子伴侶促進了T1144的折疊。每升大腸桿菌中，約可獲得重組蛋白20 mg以上，成功解決了

5、含多疏水性氨基酸序列蛋白的表達問題。本實驗通過基因重組技術將不同功能的多肽連接，同時設計了一段富含親水性的氨基酸的小分子多肽連接序列——L35(G-G-G-G-S)7作為柔性序列，最大程度上解決空間位阻問題，從而得到具有雙功能的重組蛋白FLT。在HIV-1ⅢB和Bal病毒抑制實驗中，F(xiàn)LT均在低納摩爾級表現(xiàn)出病毒抑制能力，其IC50值分別為11.39 nM和14.90 nM。重組蛋白FLT對臨床病毒株同樣表現(xiàn)出很強的病毒抑制能力。

6、>　　HIV-1融合抑制劑的主要作用機制是抑制病毒與靶細胞膜的融合，而HIV-1表面膜蛋白gp41六螺旋核心束的形成是gp41介導膜融合過程中的關鍵步驟。通過六螺旋競爭實驗和熒光非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(FN-PAGE)實驗，發(fā)現(xiàn)重組蛋白FLT發(fā)揮高效抗病毒作用的機制是干擾gp41的NHR和CHR形成六螺旋核心束。
　　采用等溫滴定量熱技術(ITC)和表面等離子共振技術(SPR)檢測重組蛋白FLT在體外與人血清白蛋白的結合情況，得

7、到重組蛋白FLT與人血清白蛋白的結合常數(shù)Ka為2.50×106，結合比為2.711。
　　本實驗采用雙抗夾心ELISA法對FLT重組蛋白、T1144多肽及T20多肽進行定量檢測。藥物代謝動力學研究表明，單次尾靜脈注射FLT蛋白后血清藥物濃度消除呈非線性消除。T20多肽的半衰期約為1.22±0.2h，T1144多肽的半衰期約為7.48±0.4 h，F(xiàn)LT重組蛋白的半衰期可達27.10±6.9 h，達到T20多肽半衰期的22.19倍，

8、T1144多肽半衰期的3.62倍。注射FLT蛋白、T1144多肽和T20多肽后，不同時間點的血清樣本對HIV-1病毒抑制效果呈現(xiàn)出與體內(nèi)藥物濃度相同趨勢變化。
　　同時，本實驗對下一代雙功能HIV融合抑制劑2DLT與抗艾滋病藥物的協(xié)同作用進行研究，證實2DLT可以與抗逆轉錄病毒藥物組合使用具有互補和協(xié)同效應，表明2DLT可進一步開發(fā)成一個新的蛋白類抗HIV藥物，可與其他抗HIV藥物聯(lián)用來治療那些已對現(xiàn)有的抗逆轉錄病毒藥物產(chǎn)生高度耐