細(xì)小病毒B19獨(dú)特區(qū)磷脂酶A2功能初步研究.pdf

1、人類(lèi)細(xì)小病毒B19于1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)獻(xiàn)血員中。它是目前僅有的兩種可以感染人的細(xì)小病毒，在全世界廣泛分布。它可感染各個(gè)年齡段的人群，并引起多種不同癥狀。在世界眾多地方，許多育齡婦女都是B19病毒的易感人群。如果懷孕期間感染該病毒，則可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血、NIFH、胎兒損傷、胎兒死亡等一系列癥狀。B19病毒的檢測(cè)方法有電鏡觀察，B19抗原酶聯(lián)免疫，血細(xì)胞凝集測(cè)定等，目前常用的是直接雜交和PCR法。 本文中，我

2、們運(yùn)用比普通單輪PCR更靈敏的巢式PCR方法檢測(cè)了共1700個(gè)血清樣本的DNA，包括從湖北省婦幼保健院采集的900個(gè)婦女及孩章血液樣本以及從武漢市第六醫(yī)院采集的800例成年人（男女均有）血液樣本。第一組（婦女組）的陽(yáng)性檢測(cè)率為8.33％，第二組（普通成人，包括男性和女性）為4.50％。結(jié)果顯示，育齡婦女的B19感染率遠(yuǎn)高于普通人群，很有必要對(duì)孕婦進(jìn)行診斷從而預(yù)防新生兒感染B19病毒。 B19病毒基因組全長(zhǎng)約5.6kb，編碼一個(gè)

3、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，以及兩個(gè)組成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白：VP1（84kDa）和VP2（58kDa），除了VP1的N-末端多了由227個(gè)氨基酸組成的VP1獨(dú)特區(qū)外，其余部分兩者完全一致。最近對(duì)大約30種不同的細(xì)小病毒研究發(fā)現(xiàn)，VP1蛋白的N-末端獨(dú)特區(qū)有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)模型（HDXXY），并且具有磷脂酶A2活性，同樣的現(xiàn)象也在細(xì)小病毒B19中發(fā)現(xiàn)。磷脂酶A2已經(jīng)成為抗體藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)潛在靶標(biāo)。因此，對(duì)細(xì)小病毒B19獨(dú)特區(qū)的研究具有重要意義，目前國(guó)

4、內(nèi)該方面的研究很少。 本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)定點(diǎn)突變改變VP1蛋白獨(dú)特區(qū)的關(guān)鍵氨基酸，檢測(cè)其磷脂酶活性是否改變，從而研究該病毒獨(dú)特區(qū)的功能。本文將獨(dú)特區(qū)序列（VP1u）插入到PUC-18a載體中，重組質(zhì)粒PUC-uVP1經(jīng)PCR擴(kuò)增得到突變體克隆，測(cè)序確認(rèn)后，再將包含有突變位點(diǎn)的獨(dú)特區(qū)構(gòu)建到表達(dá)載體pMal-c2x中，獲得重組克隆pMal-uVP1。運(yùn)用此方法，順利突變了其中的133，153，174這三個(gè)關(guān)鍵氨基酸。然后在大腸桿菌中表達(dá)